Отзывы владельцев Lada (ВАЗ) 21099 (Лада 21099) с фото, плюсы и минусы, достоинства и недостатки

Отзывы владельцев Lada (ВАЗ) 21099 (Лада 21099) с фото, плюсы и минусы, достоинства и недостатки — Авто Mail.ru

—

Коробка передач

Объем двигателя, л

—Авто чисто для передвижения из точки а в точку б, комфорт чисто символический , из + наличие и стоимость запчастей, большинство операций по ремонту можно выполнить минимальным набором инструментов…Про 21099 наверное уже много написано и рассказано. Моя история в том, что этот автомобиль в нашей семье уже 15 лет и за это время накатал почти 800 тыс пробега и сдаваться не собирается.
Коробка…

3

Всем доброго времени суток! Нормально и без изыска. Брал в 2011 году из под дедушки (за 95000 просил100000 ниже не двигался) Первый владелец зимой не эксплотировал+гаражное хранение.состояние нового…

2

Машину эту брал с рук. Я был третьим хозяином. На момент покупки ей уже было 9 лет. Сразу пришлось поменять генератор и ручной тормоз. Но после этого я горя не знал. В течение 5 лет ездил меняя…Купил в салоне украинской сборки под такси. Через год эксплуатации поставил газо-балонное оборудование для метана. Разменял уже 700 000 км без капитального ремонта двигателя ( ну, там замена колец и…

3

объездил всю Россию, лучше машины не видал, и до сих пор езжу, хотя есть Вольво s80Купил ваз 21099(седан) в декабре 2016 года, за цену в 60к деревяных вполне нормальный автомобиль, при заботе и бережном отношении лучший российский(советский автомобиль)

1

Владел 099 три года.По сравнению с классикой сказка.Не прихотливая,особенно карбюраторная.

1

( ВАЗ 210994, 1,6 л.)ОТЛИЧНАЯ МАШИНА ,ОЧЕНЬ НАДЕЖНАЯ,ЗА ЭТОТ ПЕРИОД НИ РАЗУ НЕ ПОДВЕЛА,ПЕРВАЯ ЗАМЕНА 2000 КИЛОМЕТРОВ МАСЛО ПРИМЕНЯЛ ZIG 5W40 , НА 5000 КМ ПОМЕНЯЛ СНОВА ,МАСЛО ТОЖЕ И ПРОЕХАЛ 10000 км…

2 комментария

рекомендую для тех, кто НЕ возит много тяжелых вещей, старается экономить на топливеМашина была куплена с "рук" в первое время после моей "семёрки". …она оказалась очень "управляемой" . У нас в Башкирии дороги более-менее…. а в лесу….за ягодами…Сложно написать отзыв о машине репутация которой около 20-ти лет. Тут пожалуй есть всё: и хорошее и плохое. Напишу о своей машине конкретно, хотя моей первой машиной как раз и была когда то ВАЗ 21099…

73 комментария

Машина хоть и старенькая по годам, но очень надёжная, по-серьёзному ни разу не подводила, как говориться сел и поехал, в любой мороз запускается с пол оборота

5

сколько бы не говорили про ТАЗики — по мне она лучше любой иномарки. да, гремит, да, скрипит, но извините меня — за 150 000 км пробега только поменять свечи и наконечники рулевых….
рабочая лошадка…

4

Я оставляю отзыв про АВТОМОБИЛЬ, который поразил меня своей функциональностью, надежностью, неприхотливостью и невероятной выносливостью!
Сразу оговорюсь, что помимо этого автомобиля есть также…

16

Я считаю, что мне повезло и с семьёй, в которой я родился, и с авто, который мне достался. Я родился в 90м, машина куплена в 99м. Помню как она пахла с завода, и, соответсвтвенно, многое другое о ней…

16

Хорошая машина для города и не далёких путешествий.
Я третий владелец данного автомобиля. "Перетряс" все узлы и агрегаты,двигатель чистый — ни масло ни тосол не подтекает, полностью…

3

интересного для себя, ну это ладно. Давно хотел написать свои отзывы о пользовании автомобилей ибо, когда выбирал сам немеренно прочитал.
Вообщем появления в своей жизни я ждал очень долго, был…

9

Купил в 2010 году. Пробег был 42500. Первое впечатление — машина НОВАЯ! Предыдущий хозяин сказал, что лично выбирал ее в Тольятти по блату. После пригона ее загнали в сервис и перебрали полностью…

6

Может у меня отзыв получился не объективный потому что были до ВАЗ21099 немецкие и японские авто и привык наверное человеческим машинам. Владел 21099 всего пол года с января по сентябрь, но узнал…

8

Помогите людям с выбором — расскажите о своем опыте использования автомобиля.

Написать отзыв

<div data-module=»SlotModel» data-view=»SlotView.345798″ data-id=»345798″ data-qa=»LazyBody.block.cpfModules»></div>

Шины и диски для ВАЗ 21099, размер колёс на Lada 21099

Отзывы владельцев ВАЗ (Lada) 21099 1993 (VAZ (Лада) 21099)

Lada Forma – 4-дверный седан ВАЗ-21099 Волжского автомобильного завода, под таким названием продавался на рынке Германии.

Данная модель — это, по сути, «девятка» с 4-дверным кузовом типа седан. Заключительная модель из семейства «Samara» отличалась от всех своих предшественников длиной габаритов, что за счет увеличения свеса сзади увеличилась на целых 200 миллиметров по сравнению с другими автомобилями данного семейства.

У новой модели дизайнерская облицовка радиатора, передние крылья и капот были исполнены без «маски» из пластика, с тахометром в наборе приборов. Преимущества и достоинства автомобиля ВАЗ-21099, так же, как и остальных моделей из семейства «Самара»: хорошая управляемость, высокие скоростные качества, устойчивость на разных типах дорог. Дополнительный выигрыш дает кузов седан с большим просторным багажником.

Данное авто в комплектации «норма» (ВАЗ-210992-01) с передним приводом с бензиновым карбюраторным силовым агрегатам с рабочим объемом 1,3 литров (ВАЗ-210993) и пяти-скоростной коробкой передач-механикой. Главным недостатком карбюраторного двигателя 1,3-литровый и с мощностью 64-силы является риск погнуть клапаны во время обрыва ремня привода распределительного вала. Оснащение приборной панели включает в себя изящную комбинацию всех приборов. В автомобиле установлена приборная панель с «низкой» полкой первых образцов. Из излишеств — корректор фар, штатная магнитола, обогреватель салона (печка).

В нынешнее время ВАЗ-21099 по-прежнему считается одной из наиболее престижных отечественных машин и, как и прежде, высоко котируется на автомобильном рынке как очень удобный и практически уже привычный и очень практичный автомобиль. Стоит, пожалуй, сказать, что на этом, седане для города, в принципе, всё-таки можно систематически выезжать семьёй на дачу.

«Острое» управление рулём, так характерное для автомобилей ВАЗа с передним приводом, на «99» немного размыто достаточно большей валкостью этого удлиненного седана на виражах. Жесткая подвеска не лучше и не хуже, чем у некоторых иномарок. Поэтому, удобство при езде не является самым лучшим качеством этой машине. Заметим, что сиденья мягкие, потолок – тоже мягкий, а все остальные детали выполнены из пенополиуретана и резины, так что седан среди своих соотечественников достаточно безопасен и внутри.

Впрочем, учитывая ранг модели, будьте готовы переплатить! Если вы покупаете «Спутник» ВАЗ-21099, то заплатите чуть меньше, ну, а если это готовая на экспорт Samara Forma – сумма будет чуть больше. Данное авто с пробегом 79000 км приобрели в Германии за 2500 евро.

Только зарегистрированные пользователи могут оставлять комментарии.

Лада 21099 — Автомобили — Автокадабра

ОАО «АвтоВАЗ» — крупнейший производитель легковых автомобилей в России и Восточной Европе. Его доля в валовом внутреннем продукте нашей страны составляет около 1%.

«АвтоВАЗ» является градообразующим предприятием для почти миллионного Тольятти. Именно поэтому в состав акционерного общества входят подразделения, обеспечивающие питание, транспортные услуги, медицинское обслуживание, отдых, а также оказывающие помощь в воспитании детей.

Строительство завода началось в 1967. Первая очередь, рассчитанная на выпуск 220 тыс. автомашин в год, вступила в строй в 1971.

За основу при выпуске малолитражного автомобиля с пятиместным кузовом ВАЗ-2101 «Жигули» был взят итальянский FIAT-124. «Копейка» задумывалась, как народный автомобиль, который при сравнительно невысокой цене мог бы насытить огромный советский рынок. Однако сразу же пришлось отказаться от мысли о доступности автомобиля для рядового человека: с каждой новой моделью цена на «Жигули» значительно росла.

Тем не менее процесс усовершенствования «Жигулей», а затем в 80-е годы экспортного варианта «Лада» никогда не останавливался. За советский период существования был освоен выпуск девяти моделей, среди которых самыми популярными стали, кроме первой, шестая и с ведущими передними колесами девятая модели.

Когда в 1976 году на заводе в Тольятти освоили производство модели ВАЗ-2106, которая была переработана для отечественных условий эксплуатации из RAT 124 Speciale образца 1972 года, никто не мог и предположить, что именно она станет самой популярной и массовой продукцией Волжского автозавода.

Вездеход «Нива» (ВАЗ 2121/2123/21213/2131) произвел сенсацию на мировом рынке в конце 1970-х  — начале 1980-х годов. Тогда этот автомобиль испытывал трудности со сбытом на отечественном рынке. В 1980 автомобилю «ВАЗ-2121» присуждена золотая медаль 53-й Международной ярмарки в Познани.

Представшая публике в конце 1984 года клиновидная «Самара» с трехдверным кузовом хэтчбек стала воистину эпохальным событием не только для Волжского автозавода, но и для отечественных автолюбителей. Модель ВАЗ-2108 Спутник/Lada Samara положила начало массовому выпуску в стране переднеприводных легковых автомобилей.

В 1987 коллектив Волжского автомобильного завода удостоен приза «Золотой Меркурий» за большой вклад в развитие производства и международного сотрудничества. Эта престижная награда была присуждена ВАЗу в третий раз.

1989 Внешнеторговому объединению «АвтоЛАДА» присужден международный приз совета торговых руководителей «Trade Leaders Club» за выход на ведущие позиции в торговле и вклад в развитие национальной экономики африканских стран.

После распада Советского Союза АвтоВАЗ, как и все остальные отечественные промышленные гиганты, вступил в полосу полной перестройки своей деятельности. Кризис оказался затяжным, но к середине 90-х годов АвтоВАЗ сумел переломить ситуацию и постепенно стал наращивать производство.

Микролитражная ВАЗ-11113 «Ока» более десятилетия остается самым дешевым отечественным легковым автомобилем. В свое время ее даже прочили на роль -народного автомобиля и определяли местом ее производства гигантский промышленный комплекс в Елабуге, намереваясь покончить с многолетним автомобильный дефицитом. Но эти проекты так и ocтались неисполнимыми, а столь досаждавшая АвтоBA3y сборка «Оки» была в середине 1990-х окончательно передана на заводы СеАЗ (который вошел в состав АвтоВАЗа) и КамАЗ.

За период 1970 — 2002 годов предприятием выпущено более 21 млн. автомобилей, а существующий на сей день производственный потенциал автомобильного комплекса позволяет выпускать свыше 700 000 автомобилей в год.

Автомобили — Berkat

Населенный пункт

Марка

ИномаркиОтечественныеAcuraAlfa RomeoAston MartinAudiBentleyBMWBrillianceBugattiBuickBYDCadillacChangFengCheryChevroletChryslerCitroenDaciaDaewooDaihatsuDaimlerDatsunDerwaysDodgeDong FengDoninvestFAWFerrariFiatFordGeelyGMCGreat WallHafeiHondaHuangHaiHummerHyundaiInfinitiIran KhodroIsuzuJACJaguarJeepKiaLamborghiniLanciaLand RoverLexusLifanLincolnLotusMaseratiMaybachMazdaMercedes-BenzMercuryMGMiniMitsubishiNissanOpelPeugeotPontiacPorscheProtonRenaultRolls-RoyceRoverSaabSaleenSaturnScionSEATSkodaSmartSsangYongSubaruSuzukiTatraTeslaToyotaTrabantVolkswagenVolvoVortexXin KaiZXВАЗГАЗЗАЗЗИЛИЖКАМАЗЛУАЗМосквичСеАЗТагАЗУАЗ

Модель

ВыбратьCLELIntegraMDXNSXRDXRLRSXTLTSXДругое. ..—1451461471551561591641663375AlfettaBreraGiuliettaGTGTVSpiderДругое…—DB-7DB-9DBSV-12 VanquishV-8Другое…—1002008090A-2A-3A4A-5A6A-8AllroadCabrioletCoupeQ-3Q-5Q-7QuattroR-8RS-4RS-6S-2S-3S-4S-5S-6S-8TTV-8Другое…—ArnageAzureBrooklandsContinentalMulsanneTurbo RДругое…—1161181201302315316318320323324325328330335518520523524525525I5285305355405455506286306356456507725728730732735740745750760850M-3M-5M-6X-3X5X-6Z-1Z-3Z-3MZ-4Z-4MZ-8Х-1Другое…—M-1M-2Другое…—57SC AtlanticEBДругое…—CenturyEnclaveLe SabrePark AvenueReattaRendezvousRivieraRoadmasterSkylarkДругое…—F3Flyer IIДругое…—BLSCateraCTSDe VilleEldoradoEscaladeFleetwoodSevilleSRXSTSXLRДругое…—FlyingSuvДругое…—A-520AmuletFlagcloudForaKimoOriental SonQQ-6SweetTiggoДругое…—AleroAstroAvalancheAveoBerettaBlazerC-10CamaroCapriceCaptivaCavalierCobaltColoradoCorsicaCorvetteCruzeEpicaEquinoxEvandaExpressGeo StormHHRImpalaLacettiLanosLuminaMetroNivaOrlandoPrizmRezzoSavanaSilveradoSparkSSRStarcraftSuburbanTahoeTrackerTrailBlazerUplanderVanVentureVivaДругое…—300C300MAspenCirrusConcordeCrossfireFifth AvenueGrand VoyagerIntrepidLe BaronLHSNeonNew YorkerPacificaProwlerPT CruiserSaratogaSebringStratusTown&CountryTrackerVisionVoyagerДругое…—AXBerlingoBXC1C-2C-25C3C4C-4 PicassoC-5C-6C-8EvasionJumperJumpyLNASaxoVisaXantiaXMXsaraXsara PicassoZXДругое…—1410Другое…—DamasEsperoEvandaGentraKalosLacettiLanosLeganzaLE MansMagnusMatizNexiaNubiraPrinceRacerRezzoTacumaTicoДругое…—AltisApplauseAstraiBe-GoBoonCharadeCopenCrafterCureEsseFerozaMateriaMiraMovePyzarRockySirionStoriaTeriosYRVДругое…—2.8LimousineДругое…—Другое…—313150AuroraCowboyPlutusShuttleДругое…—AvengerCaliberCaravanChallengerChargerDakotaDurangoGrand CaravanIntrepidMagnumNeonNitroRAMRamchargerShadowSpiritStealthStratusViperДругое…—MPVДругое…—AssolKondorOrionДругое…—AdmiralJinnVitaДругое…—360430599612CaliforniaEnzoF-355MaranelloMondialTestarossaДругое…—131AlbeaBarchettaBravaBravoCinquecentoCromaCupeDobloDubloFiorinoMareaMultiplaNew-500PalioPandaPuntoRegataRitmoSediciSeicentoStiloTempraTipo—AerostarBroncoCapriC-MaxContourCrown VictoriaEconolineEdgeEscapeEscortExcursionExpeditionExplorerF-150FiestaFiesta STFive HundredFocusFocus STFreestyleFusionGalaxyGranadaGTKAKugaMaverickMondeoMustangOrionProbePumaRangerScorpioShelbySierraS-MaxTaunusTaurusTempoThunderbirdTourneo ConnectWindstarДругое. ..—MKOtakaДругое…—AcadiaEnvoyJimmySafariSavanaSierraSonomaSuburbanYukonДругое…—DeerHoverSafeSailorSocoolSUFSUVWingleДругое…—BrioPrincipSimboДругое…—AccordAirwaveAvancierCapaCityCivicCivic-4DCivic-5DCivic ShuttleConcertoCR-VCRXDomaniEdixElementFerioFitFit AriaFR-VHR-VInsightInspireIntegraJazzLegendLifeLogoMobilioNSXOdysseyOrthiaPartnerPassportPilotPreludeRafagaRidgelineS-2000SaberShuttleSm-xS-MXStepwgnStreamTorneoVamosVigorZДругое…—AntelopeДругое…—H-1H-2h4HummerДругое…—AccentAtosAvanteCupeElantraEquusGalloperGetzGrandeurGrand StarexH-100H-1 StarexI-20LavitaMarciaMatrixNFPonySanta FeSantamoS-CupeSolarisSonataTBTerracanTiburonTrajetTucsonTuscaniVelosterVeracruzVernaXGДругое…—EXEX-35EX-37FX35FX-45FX-50G35G-37i30I-35J-30M-35M-45Q-45QX-4QX-56Другое…—SamandДругое…—AscenderAskaAxiomBighornGeminiImpulseRodeoTrooperVehiCrossWizardДругое…—RefineReinДругое…—E-TypeS-TypeXFXJXJ-8XJRXJSXJS CupeXK-8XKRX-TypeДругое…—CherokeeCJ5 — CJ8CommanderCompassGrand CherokeeLibertyPatriotWranglerДругое…—AvellaBestaBorregoCapitalCarensCarnivalCeedCeratoClarusForteJoiceMagentisOpirusOptimaPicantoPotentiaPredioPridePro CeedRetonaRioSedonaSephiaShumaSorentoSoulSpectraSportageVistoДругое…—DiabloEspadaGallardoMurcielagoДругое…—BetaDedraDeltaKapaLybraPhedraThemaThesisYДругое…—90DefenderDiscoveryFreelanderLand RoverRange RoverRange Rover SportДругое…—ES-300ES-330ES-350GS-300GS-350GS-400GS-430GS-450hGS-460GXIS-200IS-250IS-300IS-350IS-FLS-400LS-430LS-460LS-600LX-450LX-470LX-570RXRX-300RX-330RX-350RX-400hSC-300SC-400SC-430Другое…—BreezSmilyДругое…—ContinentalLincoln AviatorLSMarkMark LTMKXMKZNavigatorTown CarZephyrДругое…—EliseSuper-7ИксайджДругое…—22832000GT43000GT CupeBiturboCupeGrandSportGranTurismoQuattroporteSpyderДругое…—5757SДругое…—1212332356626929AtenzaAxelaAZ-WagonBBongoBT-50CapellaCarolCX-7CX-9DemioE-2000Eunos-500Eunos CosmoFamiliaLantisLevanteLuceMilleniaMPVMX-3MX-5MX-6PremacyProtegeRoadsterRX-7RX-8TributeVerisaXedos-6Xedos-9Другое. ..—190200220230240250260280300500A-140A-150A-160A-170A-180A-190A-200A-210B-170B-180B-200C-180C-200C-220C-230C-240C-250C-270C-280C-320C-32 AMGC-350C-36 AMGC-55 AMGC-63 AMGCabrioC classCL-420CL-500CL-55 AMGCL-600CL-63 AMGCL-65 AMGCLC-220 CDICLK-200CLK-220CLK-230CLK-240CLK-270CLK-320CLK-350CLK-430CLK-500CLK-55 AMGCLK-63 AMGCLS-320CLS-350CLS-500CLS-55 AMGCLS-63 AMGCupeE-190E-200E-210E-220E-230E-240E-250E-270E-280E-290E-300E-320E-350E-400E-420E-430E-500E-50 AMGE-55 AMGE-63 AMGG-230G-250G-270G-280G-290G-300G-320G-350G-400G-500G-55 AMGGL-320GL-420GL-450GL-500GL-550GLK-ClassML-230ML-270ML-280ML-320ML-350ML-400ML-430ML-500ML-55 AMGML-63 AMGPullmanRR-320R-350R-500S-260S-280S-300S-320S-350S-380S-400S-420S-430S-450S-500S-550S-55 AMGS-560S-600S-65 AMGS classSL-280SL-300SL-320SL-350SL-380SL-420SL-450SL-500SL-55 AMGSL-600SL-63 AMGSL-65SLK-200SLK-230SLK-280SLK-320SLK-32 AMGSLK-350SLK-55 AMGSLR McLarenSmartT-RexV-200V-220V-230V-280VaneoVianoДругое…—CapriGrand MarquisKugaMarinerMontegoMountainMystiqueSableTopazTrackerVillagerДругое…—MGBMGFTFZRZTДругое…—ClubmanCooperHatchOneДругое…—3000GTAirtrekAspireASXCarismaChallengerChariotColtDebonairDelicaDiamanteDingoDionEclipseeK-WagonEmeraudeEndeavorFTOGalantGolden StarGrandisGTOIL200LancerLancer-10Lancer-9Lancer CediaLancer EvolutionLegnumLiberoMinicaMirageMonteroMontero SportOutlanderPajeroPajero IOPajero SportRVRSapporoSigmaSpace GearSpace RunnerSpace StarSpace WagonStarionTown BoxДругое…—100NX200SX300ZX350ZADAlmeraAlmera ClassicAlmera TinoAltimaArmadaAvenirBassaraBluebirdCedricCefiroCentreCherryCimaCubeDatsunElgrandExpertFairladyFrontierFugaGloriaGT-RJukeKing CabLafestaLargoLaurelLeopardLibertyLucinoMarchMaximaMicraMistralMocoMuranoNavaraNoteNP-300PathfinderPatrolPickupPrairiePrairie JoyPresagePreseaPrimeraPulsarQashqaiQuestRasheenRnessaRougeSafariSerenaSilviaSkylineStageaStanzaSunnyTeanaTerranoTiidaTinoTitanUrvanVanetteWingroadX-TerraX-TrailДругое…—AgilaAntaraAsconaAstraAstra OPCCalibraCampoComboCommodoreCorsaCorsa OPCFronteraGTInsigniaKadettMantaMerivaMontereyMovanoOmegaRekordSenatorSignumSintraSpeedsterTigraVectraVitaZafiraДругое. ..—100710610720520620730083013053063073083094007405406407605607806807Другое…—6000AztecBonnevilleFieroFirebirdGrand AmGrand PrixGTOPhoenixSolsticeSunbirdSunfireTrans SportVibeДругое…—911924928944968BoxsterCarrera GTCayenneCaymanДругое…—Persona-300 CompactPersona-400Другое…—11181920212559AvantimeClioClio SymbolDusterEspaceFluenceFugaGrand ScenicKangoo ExpressKangoo PassengerKoleosLagunaLoganMasterMeganeModusRapidSafraneSandero StepwayScenicScenic RXSuper-5SymbolTraficTwingoVel SatisДругое…—Corniche CabrioDrophead CoupePhantomSilver-SeraphSilver SpurДругое…—200254004560075800MaestroMini MKMontegoДругое…—90090009-2X9-39-59-7X99Другое…—S-7Другое…—IonLSSCSLVUEДругое…—tCXAxBДругое…—AlhambraAlteaArosaCordobaIbizaLeonMalagaRondaToledoДругое…—FabiaFavoritFeliciaOctaviaOctavia ScoutRoomsterSuperbДругое…—CrossbladeForfourFortwoRoadsterДругое…—ActyonCharmanFamilyIstanaKorandoKyronMussoRextonRexton-2RodiusTagerДругое…—B-9BajaForesterImprezaImpreza WRXJustyLegacyLeoneLiberoOutbackPleoR-2StellaSVXTraviqTribecaTXVivioWRX STIДругое…—AerioAltoBalenoCultus WagonEscudoEveryEvery LandyForenzaGrand VitaraIgnisJimnyKeiLianaMR WagonSamuraiSidekickSwiftSX4VeronaVitaraWagon R+X-90XL-7Другое…—T-613Другое…—Другое…—4-RunnerAllexAllionAlphardAltezzaAristoAurionAurisAvalonAvensisAvensis VersoBBBrevisCaldinaCamiCamryCamry SolaraCaribCarinaCarina ECarina EDCavalierCelicaChaserCorollaCorolla CeresCorolla FielderCorolla FXCorolla LevinCorolla RumionCorolla RunxCorolla SpacioCorolla VersoCoronaCorsaCressidaCrestaCrownCrown AthleteCrown MajestaCynosDuetEchoEstimaEstima EminaExivFJ CruiserFortunerFuncargoGaiaGrand HiaceGranviaHarrierHiaceHighlanderHilux PickupHilux SurfIpsumIsisIstKarenKlugerLand CruiserLand Cruiser-100Land Cruiser-105Land Cruiser-200Land Cruiser-70Land Cruiser-80Land Cruiser Prado-120Land Cruiser Prado-150Land Cruiser Prado-90Lite AceMark-2Mark XMasterAceMatrixMR-2MR-SNadiaNoahOpaOriginPassoPicnicPlatzPortePremioPreviaPriusProboxProgresPronardRactisRaumRAV4RegiusRegius AceScepterScionSequoiaSeraSiennaSientaSoarerSolaraSparkySprinterSprinter MarinoStarletSucceedSupraTacomaTercelTown Ace NoahToyo AceTundraVellfireVenzaVerossaVistaVitzVoltzVoxyWillWill CyphaWindomWishYarisYaris VersoДругое. ..—P-601Другое…—BeetleBoraCaddyCaravelleCorradoEosFoxGolfGolf PlusJettaKaeferLupoMultivanNew BeetlePassatPhaetonPointerPoloSantanaSciroccoSharanTaroTiguanTouaregTouranVentoДругое…—164240340440K460L480E740760850940960BertoneC-30C-40C-70S40S60S-70S-80S-90V-40 KombiV-50V-70XC-70XC-90Другое…—Другое…—Pickup X-3SR-V X-3Suv X-3Другое…—GrandTigerLand MarkПикапДругое…—ОкаКалина210121022103210421052106210721082109210992110211121122113211421152120 (Надежда)НиваПриораГрантаВестаLargusДругое…—131420212224241031023102931103110531116769M-1Другое…—1102110311051140965968ChanceSensВидаДругое…—1141174104Другое…—2125212627152717412ОдаДругое…—ОкаДругое…—967968969Другое…—2125214021412335400401402403406407408412423 Комби5846Aslk-2138Aslk-2140Князь ВладимирКомбиСвятогорЮрий ДолгорукийДругое…—1111Другое…—ТагерДругое…—22063151315231533159316031623163452469ПатриотХантерДругое…

Тип кузова

ВнедорожникКабриолетКроссоверКупеЛимузинМинивэнПикапСеданУниверсалХетчбэк

Трансмиссия

АКППМКППРоботВариатор

Вид топлива

БензинДизельГибрид

Объем двигателя

от 0.91.01.11.21.31.41.51.61.71.81.92.02.12.22. 32.42.52.62.72.82.93.03.13.23.33.43.53.63.73.83.94.04.14.24.34.44.54.64.74.84.95.05.15.25.35.45.55.65.75.85.96.06.16.26.36.46.5
до 0.91.01.11.21.31.41.51.61.71.81.92.02.12.22.32.42.52.62.72.82.93.03.13.23.33.43.53.63.73.83.94.04.14.24.34.44.54.64.74.84.95.05.15.25.35.45.55.65.75.85.96.06.16.26.36.46.5 л

Привод

ЗаднийПереднийПолный

Руль

ВыбратьЛевыйПравый

Цвет

КрасныйКоричневыйОранжевыйБежевыйЖёлтыйЗелёныйГолубойСинийФиолетовыйПурпурныйРозовыйБелыйСерыйЧёрныйЗолотойСеребряный

Состояние

ВыбратьНовыйХорошееСреднееБитый

Тип сделки

ВыбратьПродаюКуплюСдаюСнимуОбменПредлагаюТребуетсяИщуИнформация

Измерение на месте электрического потенциала через фагосомную мембрану с использованием FRET и его вклада в протонодвижущую силу

Аннотация

Фагосомы используют литические ферменты, катионные пептиды и реактивные кислородные промежуточные соединения для уничтожения вторгающихся микроорганизмов. Эффективность этих микробицидных механизмов усиливается кислым pH, создаваемым H ⁺ -перекачивающими АТФазами вакуолярного типа (V-АТФазами) на фагосомную мембрану.Степень фагосомного закисления сильно различается среди нейтрофилов, макрофагов и дендритных клеток и может зависеть от таких заболеваний, как кистозный фиброз. Детерминанты pH фагосом до конца не изучены, но предполагается, что проницаемость для ионов, которые нейтрализуют электрогенный эффект V-АТФазы, играет центральную роль. Когда противоионная проводимость ограничена, генерация большого мембранного потенциала будет преобладать над протонодвижущей силой ( пмс ) с пропорционально уменьшенным градиентом pH.Подтверждение этого понятия требует прямого измерения электрического потенциала, который развивается через фагосомную мембрану ( _Φ ). Мы описываем неинвазивную процедуру для оценки _Φ в интактных клетках на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии. Этот подход в сочетании с измерениями pH фагосом позволил нам рассчитать pmf по фагосомам макрофагов мышей и проанализировать факторы, ограничивающие закисление. В устойчивом состоянии _Φ составляло в среднем 27 мВ (положительный люмен) и только частично рассеивалось за счет ингибирования V-АТФазы конканамицином A.Сравнительно небольшой вклад потенциала в pmf предполагает, что протонная накачка не ограничивается проницаемостью противоионов, понятие, которое было подтверждено независимо с использованием ионофоров. Вместо этого pH фагосом стабилизируется, когда скорость протонной перекачки, которая постепенно снижается по мере подкисления просвета, соответствует пассивной утечке протонных эквивалентов.

Интернализация патогенов макрофагами, дендритными клетками и нейтрофилами является важным компонентом врожденного иммунного ответа.Инвазивные микроорганизмы попадают в мембраносвязанную вакуоль, фагосому, где они впоследствии уничтожаются. Фагосомы приобретают микробицидные свойства постепенно в результате серии реакций слияния, известных как созревание. Прогрессирующее и в конечном итоге глубокое закисление просвета — отличительная и важная особенность созревания фагосом. Уровень pH в просвете достигает значений <5,5 (1, 2) за счет процесса, который зависит от АТФаз вакуолярного типа (V-АТФаз) (3). Помимо прямого воздействия на рост бактерий, фагосомное закисление важно для оптимальной активности множества микробицидных компонентов, включая ферменты разложения и образование нескольких реактивных кислородных промежуточных соединений.

В то время как известно, что V-АТФазы участвуют в подкислении, детерминанты фагосомного pH не совсем понятны. V-АТФазы присутствуют как в нейтрофилах, так и в макрофагах, но только последние демонстрируют быстрое и глубокое фагосомное закисление, тогда как фагосомы нейтрофилов первоначально подщелачивают и вызывают лишь умеренное последующее закисление (1, 4). Было высказано предположение, что потребление H ⁺ продуктами НАДФН-оксидазы объясняет это различное поведение (4), но могут быть задействованы и другие факторы.В частности, поскольку V-АТФаза является электрогенной (5), различия в скорости и / или степени подкисления могут быть вызваны вариациями проницаемости противоионов фагосомной мембраны. Действительно, недавний отчет (6) отметил, что в макрофагах от CFTR-нулевых мышей фагосомы менее кислые, и объяснил это различие пониженной проводимостью хлоридов (противоионов).

Если противоионная проводимость ограничена, V-АТФазы не смогут генерировать значительный градиент концентрации протонов, и большая часть протонодвижущей силы, генерируемой гидролизом АТФ, вместо этого будет направлена ​​на генерацию трансмембранного электрического потенциала (положительный внутри).Соответственно, постепенное изменение баланса между электрическими и химическими компонентами протонодвижущей силы ( pmf ) было предложено в качестве (одного из) механизмов, объясняющих прогрессирующее закисление эндоцитарных и секреторных путей. Увеличение количества противоионных каналов (или других проводящих объектов) может объяснить, почему лизосомы более кислые, чем ранние эндосомы, несмотря на то, что обе органеллы наделены V-АТФазами. В качестве альтернативы, причиной может быть дифференциальное выражение «утечек» H ⁺ .

Дифференциация этих моделей и более полное понимание детерминант подкисления органелл требуют точного количественного определения компонентов pmf . Надежные методы определения pH in situ фагосом и других эндоцитарных органелл доступны уже более десяти лет (7, 8). Напротив, было практически невозможно измерить электрический потенциал через мембрану эндоцитарных органелл. Здесь мы представляем метод, основанный на FRET, для измерения потенциала, генерируемого через фагосомную мембрану в живых макрофагах.Данные таких экспериментов позволили нам получить информацию об ионной проницаемости фагосом и произвести более количественное описание протонно-двигательного профиля этой органеллы.

Результаты и обсуждение

Небольшие размеры и недоступность эндоцитарных органелл не позволяют проводить их анализ традиционными электрофизиологическими методами. Чтобы обойти эти ограничения, мы использовали потенциометрический флуоресцентный краситель. Такие зонды проницаемы для мембран и могут проникать в компартменты эндоцитов.Однако высокая плотность и разнообразие эндомембранных органелл не позволяет изолировать вклад эндосом, лизосом или даже более крупных органелл, таких как фагосомы. Поэтому обязательно ограничивать измерение интересующей органеллы. С этой целью мы разработали подход, основанный на микроскопии, с использованием FRET между органеллоспецифическим донором и акцепторным красителем, чувствительным к мембранному потенциалу. Поскольку для резонансной передачи энергии требуется близкое (≤10 нм) расстояние между донором и акцептором, нацеливание одного из партнеров FRET на фагосому ограничивает измерения этой органеллой.

Потенциал-чувствительный зонд бис — (1,3-дибутилбарбитуровая кислота) пентаметиноксонол, известный как DiBAC ₄ (5), использовался для измерения фагосомного потенциала. Этот жирорастворимый анионный краситель распределяется по мембранам в соответствии с их трансмембранным потенциалом. В качестве донора для FRET мы ковалентно метили фагоцитарные частицы 7-диэтиламинокумарин-3-карбоновой кислотой (DACCA). Эту реакцию проводили путем инкубации эритроцитов барана (sRBC) с производным сложного сукцинимидилового эфира DACCA, в результате чего образуются стабильные карбоксамидные связи (рис.1
А ). Как показано на рис. 1
C и D , обилие реактивных аминогрупп на sRBC сделало мечение частиц интенсивным и однородным.

Рисунок 1.

Характеристика донора и акцептора FRET. ( A ) sRBC метили инкубацией с производным сукцинимидилового эфира DACCA.( B ) Спектры возбуждения (сплошные) и эмиссии (пунктирные) DACCA: sRBC (черный) и оксонол (серый). Серые полосы указывают ширину полосы возбуждения и излучения, используемую для визуализации FRET. ( C и D ) Меченые sRBC на покровном стекле инкубировали с ( C ) или без ( D ) DiBAC ₄ (5). Проиллюстрированы изображения, полученные в каналах DACCA, DiBAC ₄ (5) или cFRET, а также соответствующие изображения с помощью дифференциальной интерференционной контрастной микроскопии (DIC).(Масштаб: 10 мкм.)

Спектры возбуждения (сплошные линии) и излучения (пунктирные линии) меченых частиц (DACCA: sRBC) и DiBAC ₄ (5) показаны на рис. 1.
Б . Также указаны полосы пропускания, используемые для измерения FRET. Следует отметить значительное перекрытие между спектрами излучения донора и возбуждения акцептора, предсказывающее устойчивую передачу энергии, и большой (≈250 нм) стоксов сдвиг между возбуждением и излучением сенсибилизированного FRET, что минимизирует утечку излучения донора. Важно отметить, что флуоресценция как DiBAC ₄ (5), так и DACCA: sRBC практически нечувствительна к pH в диапазоне pH (от 4,5 до 7,5), который охватывает условия, с которыми сталкиваются частицы внутри фагосом [вспомогательная информация (SI), рис. . 5 А
].

Когда суспензию DACCA: sRBC титровали возрастающими количествами DiBAC ₄ (5), наблюдалось уменьшение эмиссии донора вместе с соответствующим увеличением эмиссии акцептора (SI Рис.5 В
), что указывает на то, что флуорофоры проходят FRET. Аналогичным образом, когда меченые sRBC визуализировали под микроскопом и инкубировали с DiBAC ₄ (5), сигнал FRET был легко обнаружен. Излучение, зарегистрированное в канале FRET и скорректированное с учетом любого просачивания (cFRET), показано на рисунке 1.
C Вставка . Как и ожидалось, флуоресценция в канале FRET была незначительной, когда донор (рис.
D, вставка ) или только акцептор (не показан).

Подтвердив эффективность пары FRET, мы приступили к измерению потенциала фагосомной мембраны ( _Φ ). Культивированным мышиным макрофагам линии RAW264.7 (далее называемым клетками RAW) позволяли интернализовать либо меченый DACCA, либо немеченый IgG-опсонизированный sRBC в течение 5 мин. После удаления избыточных частиц любые прилипшие (не интернализованные) sRBC гипотонически лизировались, а затем образованные фагосомы оставляли для созревания в течение 15 минут. Перед визуализацией к среде добавляли 250 нМ DiBAC ₄ (5) и давали уравновеситься на клеточных мембранах.Оксонол можно было увидеть по всему макрофагу (рис. 2).
B и E ), но сигнал, исходящий от фагосом, было трудно различить. Однако в макрофагах, которые проглотили DACCA: sRBC, сигнал cFRET был четко обнаружен и ограничен фагосомой (сравните рис.
C и F ). Обратите внимание, что интенсивность сигнала cFRET варьируется между фагосомами даже в пределах одного и того же макрофага, что указывает на присущую им гетерогенность.

Рис. 2.

FRET в живых макрофагах. Клеткам RAW позволяли интернализовать либо меченые ( A – C ), либо немеченые ( D – F ) sRBC, уравновешивали 250 нМ DiBAC ₄ (5) и отображали. Показаны флуоресцентные изображения типичного поля DIC ( A и D ), акцептора ( B и E ) и cFRET ( C и F ).DiBAC ₄ (5) распределяется по макрофагам ( B и E ) в отличие от cFRET, который ограничен фагосомами ( C ). Вставки в C и F показывают сигнал донора. (Масштаб: 10 мкм.)

Поскольку количество DACCA, связанного с мечеными sRBC, является фиксированным и практически постоянным, сигнал cFRET будет варьироваться в основном в зависимости от концентрации DiBAC ₄ (5) в непосредственной близости от них.Следовательно, флуоресценция cFRET фактически является косвенным показателем Ψ _Φ . Мы разработали процедуру калибровки, чтобы вывести величину Ψ _Φ из интенсивности cFRET. Обоснование калибровки схематично показано на рис.
А . Мы рассматриваем систему как состоящую из трех отсеков: (отсек 1) внеклеточная среда, (отсек 2) цитозоль и (отсек 3) внутрифагосомный (просветный) отсек, разделенные двумя мембранами.Известно, что разность электрических потенциалов (PM _PM ) существует через плазматическую мембрану, которая разделяет компартменты 1 и 2, тогда как предполагается, что отдельный потенциал ( _Φ ) существует через фагосомную мембрану. Концентрация оксонола в каждом из отделений будет определяться этими двумя последовательными потенциалами. В частности, для данной внеклеточной концентрации оксонола ( C
₁ ), свободная цитозольная концентрация ( C
₂ ) в состоянии равновесия строго зависит от Ψ _PM .В свою очередь, свободная внутрифагосомальная концентрация ( C
₃ ) будет функцией обоих C
₂ и Ψ _Φ . Предполагая, что свободный оксонол распределяется по мембранам в соответствии с уравнением Нернста, отношения между пятью переменными можно явно описать уравнениями

где R , T и F — газовая постоянная, температура в градусах кельвина и постоянная Фарадея соответственно, а z = −1 — заряд DiBAC ₄ (5).Следовательно, Ψ _Φ можно рассчитать, если значения C
₂ и C
₃ определены. Стоимость C
₃ определяли с помощью внешней калибровки, выполняемой путем измерения интенсивности cFRET, записанной из свободных DACCA: sRBC, при титровании увеличивающимися количествами DiBAC ₄ (5) in vitro , то есть в отсутствие клеток RAW. Полученную калибровочную кривую затем использовали для расчета внутрифагосомной концентрации DiBAC ₄ (5) из фагосомного сигнала cFRET, записанного в любом данном эксперименте по фагоцитозу.Рис. 3
В представлена ​​калибровочная кривая, полученная усреднением 14 отдельных экспериментов внешнего титрования. Пунктирная линия представляет наилучшее соответствие логарифмическим методом наименьших квадратов ( R
² = 0,991) используется для интерполяции C
₃ по измеренным значениям cFRET.

Инжир. 3.

Измерение мембранного потенциала фагосом. ( A ) Переменные для расчета Ψ _Φ . Система включает внеклеточное (отсек 1), внутриклеточное (отсек 2) и внутрифагосомное (отсек 3) пространства. Концентрация свободного DiBAC ₄ (5) в каждом отсеке обозначается как C .
_x , где x обозначает отсек. Компартменты 1 и 2 разделены плазматической мембраной, а 2 и 3 — фагосомной мембраной, каждый из которых имеет трансмембранный потенциал _PM и _Φ, соответственно.( B ) Внешняя калибровка, используемая для расчета C ₃ . cFRET регистрировали из свободных DACCA: sRBC при титровании возрастающих количеств DiBAC ₄ (5). Количество cFRET, измеренное в фагосоме, затем переводили во внутрифагосомную концентрацию DiBAC ₄ (5) (C ₃ ) с использованием эмпирически построенной калибровочной кривой. Каждая точка данных представляет собой среднее значение ± SEM 14 индивидуальных калибровок; Логарифмический метод наименьших квадратов, используемый для интерполяции C ₃ из измеренного значения cFRET, показан пунктирной линией.( C ) Ψ _PM было измерено с использованием как DiBAC ₄ (5) (закрашенная полоса; n = 10 экспериментов), так и записей с привязкой к ячейкам в режиме фиксации тока (открытая полоса, n = 10 клеток из трех экспериментов). Репрезентативная калибровочная кривая флуоресценции DiBAC ₄ (5) по сравнению с _PM показана на рис. 6 SI. ( D ) Две разные внеклеточные концентрации DiBAC ₄ (5) были добавлены к RAW-клеткам после фагоцитоза. DACCA: измерены sRBC и cFRET.Данные иллюстрируют Ψ _Φ , измеренные с использованием 125 нМ (закрашенные столбцы) и 250 нМ DiBAC ₄ (5) (светлые столбцы) до (исходный уровень) и после добавления 1 мкМ конканамицина A. Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего от 8 , 24, 5 и 6 экспериментов соответственно слева направо. Звездочки указывают на статистически значимое ( P <0,05) отличие от соответствующего исходного уровня, рассчитанного с использованием непарных тестов t .

С
₂ можно вычислить, зная C
₁ и Ψ _PM .Первый равен количеству оксонола, добавленному в среду для купания. _PM был определен эмпирически двумя отдельными методами (рис.
С ). Сначала мы измерили measured _PM электрофизиологически, исправляя макрофаги в прикрепленной к клетке конфигурации и записывая в режиме токового зажима (9). Эти измерения дали средний потенциал -69,1 ± 3,7 мВ ( n = 10 ячеек; рис.
С ). Во-вторых, мы использовали DiBAC ₄ (5) и процедуру калибровки катион-ионофора (2) для флуориметрической оценки Ψ _PM (репрезентативная калибровочная кривая показана на SI Рис.6). Потенциал, оцененный этим методом, составил в среднем -69,7 ± 5,7 мВ ( n = 10 экспериментов; рис.
С ). Эти измерения не только хорошо согласуются друг с другом, но и с более ранними определениями мембранного потенциала макрофагов RAW (10).

Используя эти параметры, мы перешли к оценке Ψ _Φ . Две разные внеклеточные концентрации DiBAC ₄ (5) ( C
₁ = 125 и 250 нМ) были использованы для минимизации возможных мешающих эффектов, вызванных истощением красителя — из-за связывания в низких концентрациях — или токсическими эффектами или сниженным отношением сигнал / шум, вызванным избытком свободного красителя.Используя внешнюю калибровочную кривую на рис.
B , мы рассчитали Ψ _Φ +27,2 ± 5,1 мВ (просвет относительно цитоплазмы) при использовании красителя 125 нМ ( n = 8 экспериментов) и +27,8 ± 2,0 мВ ( n = 24) при использовании 250 нМ (рис. 3
D ). Было высказано предположение, что аналогичные (10–20 мВ) внутриположительные потенциалы существуют в эндосомах, основываясь на измерениях концентрации хлоридов и на предположении, что проводимость по отношению к этому аниону является преобладающей (11).

Поскольку V-ATPase, основной участник закисления фагосом (3), является электрогенным насосом, мы оценили ее вклад в _Φ . Накачка протонов была остановлена ​​добавлением специфического ингибитора конканамицина А при мониторинге потенциала. Ингибирование V-АТФазы снижает напряжение почти на 50%, до +10,7 ± 1,4 мВ ( n = 5) при измерении с использованием 125 нМ DiBAC ₄ (5) и до +17,1 ± 4,7 мВ ( n = 6) при использовании 250 нМ (рис.2
D ), предполагая, что V-АТФаза является основным детерминантом _Φ . Тем не менее, потенциал через фагосомную мембрану не рассеивался полностью, несмотря на полное ингибирование V-ATPase, что подразумевает существование других способствующих процессов.

Диффузионный потенциал, генерируемый направленным внутрь градиентом K ⁺ , в принципе может объяснять остаточное фагосомное напряжение. В макрофагах, использованных в этом исследовании, внутриклеточный (в основном цитозольный) [K ⁺ ] в среднем составлял 136 ± 11 мМ (среднее ± стандартная ошибка четырех экспериментов), как измерено с помощью пламенной фотометрии (см. SI рис.6). Однако внутрифагосомальный [K ⁺ ] окончательно не установлен. Измерения нейтрофилов с помощью электронно-зондового рентгеновского микроанализа показали, что содержание K ⁺ составляет ≈300 мМ (12). Хотя авторы этого отчета предположили, что большая часть K ⁺ была свободна, это предположение является спорным, поскольку оно подразумевает, что внутрифагосомная осмолярность будет значительно превышать осмолярность цитозоля. Для получения независимой оценки свободного фагосомы [K ⁺ ] мы использовали метод титрования по нулевой точке, основанный на использовании электронейтрального ионофора K ⁺ / H ⁺ (см. SI Рис.7 для подробностей). Эти определения дали свободный [K ⁺ ] ≈20 мМ. Направление и величина градиента К ⁺ от цитозоля к просвету, следовательно, достаточны, чтобы учесть (или внести свой вклад) в разность электрических потенциалов, которая остается после ингибирования электрогенной протонной накачки. Подтверждение наличия K ⁺ -проводящего пути должно дождаться прямого измерения электрофизиологическими средствами.

В то время как вклад протонного насоса в трансмембранное напряжение сравнительно невелик (≈14 мВ) в установившемся состоянии, ожидается, что он будет больше на более ранних стадиях подкисления.Этот прогноз основан на наблюдении, что скорость подкисления, зарегистрированная сразу после запечатывания фагосом (SI рис. 8), намного превышает начальную скорость утечки протонов, не маскируемую конканамицином в установившемся состоянии (рис. 4).
D ), что, в свою очередь, эквивалентно скорости откачки на этой стадии. Это снижение оборота V-АТФазы вызвано, по крайней мере частично, прогрессивным накоплением pmf через фагосомную мембрану, что препятствует управляемой АТФ транслокации протонов.Аллостерическое ингибирование просветом H ⁺ также может способствовать замедлению. Независимо от механизма, мы смогли продемонстрировать повышенный вклад V-АТФазы в мембранный потенциал путем фиксации pH фагосомы на уровне выше нормального устойчивого состояния с использованием NH ₃ , проницаемого через мембрану слабого основания. Добавление 10 мМ NH ₄ Cl, который находится в равновесии с 90 мкМ NH ₃ при используемом pH, приводит к быстрому и устойчивому повышению pH фагосомы (не показано).Это ощелачивание сопровождалось увеличением потенциала фагосомной мембраны до значения +59,1 ± 3,3 мВ ( n = 12) относительно цитоплазмы (таблица 1). Гиперполяризация устранялась конканамицином А, что отражало повышенную активность V-АТФазы (таблица 1). Следовательно, потенциал фагосомной мембраны, вероятно, будет изменяться в ходе созревания фагосом, достигая максимума на самых ранних стадиях и снижаясь по мере того, как скорость перекачки снижается из-за подкисления просвета.

Рис. 4.

Энергетика В-АТФазы. Меченные FITC sRBC ( A ), добавленные к RAW-клеткам в качестве фагоцитирующей жертвы (, вставка ), использовали для измерений pH фагосом. Фагоцитозу давали возможность продолжаться в течение 5 минут, после чего следовали 15-минутный период созревания перед ратиометрической визуализацией. После сбора экспериментальных данных была проведена калибровка in situ .Типичная калибровочная кривая показана в B . Было измерено среднее исходное значение pH в просвете 5,22 ± 0,03 ( n = 37 экспериментов). ( C ) Типичный профиль pH отдельной фагосомы. После получения исходного значения pH добавляли конканамицин A для ингибирования V-АТФазы и отслеживали повышение pH. NH ₄ Cl (2 мМ) добавляли для временного подщелачивания фагосомы для расчета буферной способности с последующей калибровкой in situ .( D ) Фагосомам давали возможность сформироваться и достичь стабильного значения pH. Затем, где указано стрелкой, V-АТФаза ингибировалась добавлением 1 мкМ конканамицина А и FCCP был добавлен в указанной концентрации, по мере продолжения записи. Следы представляют от трех до пяти экспериментов для каждого условия. ( E ) Скорость подщелачивания как функция концентрации FCCP, из экспериментов, подобных эксперименту D . Данные представляют собой средние значения ± SEM для ≥25 фагосом по крайней мере из трех отдельных экспериментов.( Вставка ) Линеаризация данных Иди-Хофсти.

Таблица 1.

Сводка измерений Ψ _Φ

Объединив записи фагосомного напряжения с независимыми измерениями трансмембранного градиента pH, мы смогли напрямую оценить pmf через фагосомную мембрану. Затем можно применить измерения pmf , чтобы лучше сформулировать энергетику V-АТФазы.Определение pH просвета проводилось с использованием sRBC, ковалентно меченных pH-чувствительным флуоресцентным красителем (рис. 4).
A и B ). Как сообщалось ранее (1–3), мы обнаружили, что закисление фагосом начинается вскоре после запечатывания и в течение нескольких минут достигает устойчивого значения, которое сохраняется в течение длительного периода (SI Рис. 8). По 37 определениям, проведенным через 15–25 мин после приема частиц, средний pH фагосомы составлял 5,22 ± 0,03. Параллельно с этим мы также определяли цитозольный pH с помощью SNARF-5F.Эти измерения дали значение pH 7,37 ± 0,03 ( n = 7 экспериментов, каждый из которых измеряет ≥40 клеток) для цитозоля RAW-клеток и, следовательно, ΔpH 2,15 единиц pH через фагосомную мембрану. Исходя из этих измерений, было рассчитано, что pmf через фагосомную мембрану достигает 15,4 кДж / моль в установившемся состоянии (15–25 мин после попадания частиц), 2,7 кДж / моль которого вносит электрический компонент.

Наши расчеты pmf позволили нам оценить, находится ли протонный насос в электрохимическом равновесии или около него, когда pH фагосомы достигает постоянного значения.Максимальное значение pmf , которое может быть произведено V-АТФазой, можно рассчитать из свободной энергии гидролиза АТФ, которая в условиях, преобладающих в цитозоле, составляет примерно 58 кДж / моль (13). При больших градиентах pH предполагается, что ферментный комплекс перемещает приблизительно два протона на каждый гидролизованный АТФ (14, 15), и в этом случае pmf не может превышать 29 кДж / моль. Это значение почти вдвое больше, чем pmf , которое мы определили экспериментально, что означает, что связь всего процесса несовершенная.Эта несовершенная связь может быть результатом неполной эффективности реакции откачки (т. Е. Некоторая часть энергии АТФ может рассеиваться в виде тепла во время цикла откачки) и / или присутствия значительной утечки H ⁺ (эквивалент) при установившемся режиме. состояние, и в этом случае V-АТФаза не будет достигать электрохимического равновесия. Последняя возможность была рассмотрена фармакологически. Как показано на рис. 4
C , блокирование V-АТФазы конканамицином A при мониторинге pH в просвете вызывало медленное, но воспроизводимое подщелачивание, что свидетельствует о продолжающейся утечке H ⁺ .Вместе эти наблюдения показывают, что pH фагосомы находится не в термодинамическом равновесии, а в устойчивом состоянии, продиктованном эндогенными путями утечки H ⁺ (эквивалент), как другие пришли к выводу ранее (2).

Чтобы pH был неизменным, величина потока утечки должна быть идентична скорости откачки. Таким образом, мы смогли получить более полное представление о свойствах фагосомной V-АТФазы путем более точного количественного определения утечки в стационарном состоянии.Поток утечки был рассчитан как произведение скорости изменения pH на буферную способность фагосом, которая была определена как 113,8 ± 4,6 мМ / pH ( n = 26) путем пульсации слабых электролитов, как описано (16). Такое большое значение, вероятно, связано с высокой концентрацией белка (в основном гемоглобина) в эритроцитах, используемых в качестве мишеней для фагоцитов. Предполагая, что средний диаметр фагосомы составляет 4 мкм, мы вычисляем поток утечки, равный 1,92 × 10 ⁻¹⁰ моль / см ² в минуту.Следовательно, в установившемся состоянии V-АТФаза должна перекачивать поток H ⁺ идентичной величины в противоположном направлении. Поскольку насос является электрогенным, этот поток эквивалентен току 3,09 × 10 ⁻³ пА / мкм ² . Комбинируя эти измерения тока насоса с более ранними определениями скорости оборота V-АТФазы, мы можем оценить количество активных V-АТФаз в фагосоме. Было подсчитано, что фагосомы, образованные при приеме внутрь sRBC, содержат 2300 V-ATPases.Этот расчет предполагает скорость оборота ≈200 АТФ / с (M. Forgac, личное сообщение) и стехиометрию 2H ⁺ на АТФ (15) и, вероятно, обеспечивает оценку нижнего предела плотности фагосомной V-АТФазы.

Хотя и измерим, вклад Ψ _Φ в фагосомную pmf сравнительно невелик (2,7 кДж / моль от 15,4 кДж / моль). Это наблюдение предполагает существование значительной противоионной проводимости. Чтобы проверить это понятие экспериментально, мы оценили проницаемость противоионов косвенно, измерив скорость диссипации фагосомного градиента pH.Как показано на рис. 4
C и D , скорость самопроизвольного подщелачивания после добавления конканамицина низкая. Добавление проводящего протонофор карбонилцианида 4- (трифторметокси) фенилгидразона (FCCP) заметно ускоряет подщелачивание в зависимости от концентрации (рис. 4).
D и E ), подразумевая, что рассеяние градиента pH при ингибировании V-АТФазы ограничивается низкой внутренней проницаемостью для H ⁺ .Эффект FCCP является насыщенным, максимальная скорость подщелачивания достигается при ≥10 мкМ (рис. 4).
E ). Поскольку реогенный поток, индуцированный FCCP, должен согласовываться с идентичным потоком противоионов для сохранения электронейтральности, измерения скорости подщелачивания могут быть использованы для определения нижнего предела проводимости противоиона. Максимальная скорость подщелачивания 0,11 pH / мин была рассчитана путем линеаризации данных с использованием состава Eadie-Hofstee (фиг. , 4E, вставка ).Учитывая буферную способность и площадь поверхности фагосом sRBC, мы оценили ток противоиона как минимум 13 × 10 ^-3 пА / мкм ² . При высоких концентрациях используемого протонофора можно предположить, что _Φ приближается к потенциалу реверсии H ⁺ , который может быть рассчитан на основе определений внутрифагосомного и цитозольного pH. Используя это вычисленное значение Ψ _Φ , мы оцениваем проводимость противоиона как 0,089–0,11 пСм / мкм ² .Ток, переносимый этой проводимостью, значительно превышает ток, генерируемый V-АТФазой в установившемся состоянии (3,1 × 10 ^-3 пА / мкм ² ), что указывает на то, что накачка не ограничивается проницаемостью противоионов.

Последний вывод согласуется с наблюдениями, сделанными с использованием валиномицина, проводящего ионофора K ⁺ . Добавление валиномицина к фагосомам, которые достигли устойчивого состояния pH, не способствовало дальнейшему закислению, даже когда просвет содержал высокий [K ⁺ ] из-за присутствия раствора, обогащенного K ⁺ , во время фагоцитоза.Более того, скорость рассеивания градиента pH после ингибирования V-АТФазы также не была затронута валиномицином (не показано), подтверждая, что эндогенная противоионная проводимость превышает проницаемость утечки H ⁺ и что последнее ограничивает скорость pH. изменять.

Основываясь на предыдущих наблюдениях, мы предлагаем следующую модель для учета получения и поддержания постоянного фагосомного pH. Вскоре после закрытия фагосомы быстро подкисляются, потому что V-АТФаза действует беспрепятственно, а обратная утечка эквивалентов H ⁺ минимальна.Противоионная проводимость достаточна, так что, хотя появляется измеримое напряжение, оно не останавливает накачку, потому что его вклад в pmf мал по сравнению с энергией гидролиза АТФ (2,7 кДж / моль против 29 кДж / моль H ^{. +} прокачано). По мере того как просвет фагосомы становится кислым, pmf растет, постепенно противодействуя активности V-АТФазы. Также может иметь место аллостерическое ингибирование насоса, вызванное кислым pH в просвете. Параллельно увеличивается величина пассивной утечки H ⁺ по мере увеличения внешнего градиента [H ⁺ ].В конце концов, скорости откачки и утечки становятся идентичными, и в этот момент достигается установившееся значение pH. Обратите внимание, что на этой стадии мембранный потенциал невелик, что указывает на то, что противоионная проводимость не является важным детерминантом максимального фагосомного закисления. Этот вывод применим к нормальным макрофагам, но не обязательно к клеткам с аномально пониженной проницаемостью противоионов, как в случае мутантов CFTR, где пониженная анионная проводимость может ограничивать протонную перекачку, как недавно описано Di et al. (6).

Наконец, мы полагаем, что представленный здесь анализ на основе FRET для определения потенциала фагосомной мембраны может быть модифицирован и расширен для измерения мембранного потенциала других эндомембранных компартментов, которые до сих пор оставались недоступными для других подходов. Такие измерения улучшили бы наше понимание транспорта ионов и гомеостаза pH как в секреторных, так и в эндоцитарных путях.

Материалы и методы

Реагенты.

sRBC и кроличий IgG против sRBC были приобретены в MP Biomedicals (Solon, OH). Сукцинимидиловый эфир DACCA, DiBAC ₄ (5), флуоресцеинизотиоцианат (FITC) и нигерицин были от компании Molecular Probes (Юджин, Орегон). Все остальные реагенты были от Sigma – Aldrich (Сент-Луис, Миссури), если не указано иное.

Клеточные линии и культура тканей.

Клетки

RAW264.7 (номер АТСС TIB-71) были получены из Американской коллекции типовых культур (Роквилл, Мэриленд) и выращены при 37 ° C в атмосфере 5% CO. ₂ в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 5% FBS (Wisent, St.Бруно, королевский адвокат, Канада).

Маркировка и характеристика частиц.

Мечение

sRBC проводили в PBS (pH 8,7) путем инкубации в течение 90 мин при вращении при комнатной температуре. Для связывания с DACCA 0,15% суспензию sRBC инкубировали с 25-50 мкг / мл DACCA-SE; Мечение FITC выполняли с использованием 6% суспензии sRBC с 0,5 мг / мл FITC. Спектры возбуждения и испускания меченных DACCA sRBC (DACCA: sRBC) и DiBAC ₄ (5) получали с использованием флуоресцентного спектрофотометра F-2500 (Hitachi, Токио, Япония).

Визуализация живых клеток и FRET.

Покровные стекла

устанавливали в камеру Лейдена, поддерживаемую при 37 ° C на предметном столике микроскопа Leica DM IRB, оборудованного колесами для фильтров (Sutter Instruments, Novato, CA), для независимого переключения между различными фильтрами возбуждения и излучения. Свет от лампы EXFO X-Cite 120 (Exfo Life Sciences Group, Миссиссауга, Онтарио, Канада) направлялся на образец с помощью дихроичного зеркала. Излучаемый свет регистрировался камерой CCD Cascade II (Photometrics, Tucson, AZ).Колесо фильтров и камера находились под контролем программного обеспечения Metamorph / Metafluor (Molecular Devices, Даунингтаун, Пенсильвания).

В экспериментах FRET были последовательно получены три флуоресцентных канала. Конфигурации набора фильтров (перечисленные как фильтры возбуждения / дихроичности / испускания, все в нм ± ширина полосы), использованные в экспериментах FRET, были следующими: донор (DACCA) 417 ± 60/425/470 ± 40; акцептор [DiBAC ₄ (5)] 543 ± 22/565/640 ± 25; и FRET 417 ± 60/565/640 ± 25. Скорректированный FRET (cFRET) рассчитывали с использованием метода Youvan et al. (17). Коэффициенты просачивания донора и акцептора определялись путем получения изображений только с донором или акцептором, соответственно, в независимых экспериментах. Все параметры микроскопа, включая время экспозиции и коэффициент усиления камеры, оставались постоянными во всех экспериментах. Измерения интенсивности флуоресценции выполняли с использованием программного обеспечения Volocity 3 (Improvision, Inc. , Лексингтон, Массачусетс). Перед анализом изображения были вычтены из фона.

Анализ фагоцитоза.

Меченые или немеченые sRBC опсонизировали кроличьими анти-sRBC (20 мкг / мл) в течение 20 минут при комнатной температуре.Для синхронизации фагоцитоза опсонизированные sRBC депонировали на клетки RAW центрифугированием при 177 × g в течение 1 мин. Затем клетки инкубировали в течение 5 минут при 37 ° C для интернализации частиц. Оставшиеся неинтернализованные sRBC подвергали гипотоническому лизису путем инкубации в воде в течение 20 с с последующей обширной промывкой. Созревание фагосом продолжалось в течение 15 мин перед визуализацией, поддерживая клетки при 37 ° C.

Измерения мембранного потенциала фагосом.

Фагоцитоз DACCA: sRBC инициировали, как описано. В среду для купания добавляли 125 или 250 нМ DiBAC ₄ (5) и давали уравновеситься в течение 7,5 мин перед визуализацией. Базовые изображения донорного, акцепторного и FRET каналов получали в течение 10 мин. Затем клетки обрабатывали конканамицином А (1 мкМ), NH ₄ Cl (10 мМ) или обоими. После 3 мин инкубации изображения в трех каналах были получены в течение 7 мин.

Чтобы определить количество DiBAC ₄ (5) в фагосоме, свободные DACCA: sRBC помещали на покровное стекло и визуализировали.Увеличивающееся количество DiBAC ₄ (5) добавлялось к частицам, и количество FRET отображалось. Таким образом была построена калибровочная кривая, связывающая cFRET с [DiBAC ₄ (5)], и определено внутрифагосомное [DiBAC ₄ (5)]. Данные калибровки были подобраны с использованием логарифмической функции ( R
² = 0,991). _Φ был рассчитан, как описано в Результаты и обсуждение .

Измерения pH фагосом.

pH фагосом измеряли с помощью логометрической визуализации, как описано (1). Вкратце, RAW-клетки с фагосомами, содержащими FITC: sRBC, которым давали созреть в течение 15 минут, были визуализированы путем быстрого переключения между фильтрами возбуждения 485 ± 20 нм и 438 ± 24 нм при использовании дихроичных фильтров 505 нм и 535 ± 40 нм. эмиссионный фильтр нм. После сбора экспериментальных данных была проведена калибровка in situ путем последовательного омывания клеток изотоническими растворами K ⁺ (145 мМ KCl / 10 мМ глюкозы / 1 мМ MgCl ₂ /1 мМ CaCl ₂ /20 мМ Hepes или Mes), забуференных до pH от 4.5-7,0 и содержащие 1 мкМ нигерицин. Калибровочные кривые были построены путем построения зависимости отношения интенсивностей флуоресценции (490 нм / 440 нм) от pH.

Для определения буферной способности фагосом, содержащих sRBC, в среду добавляли 1 мМ или 2 мМ NH ₄ Cl в PBS, отслеживали изменение pH и рассчитывали буферную способность, как описано Roos and Boron ( 16).

Определение потенциала плазменной мембраны.

Плазматический мембранный потенциал измеряли с использованием стандартных протоколов патч-кламп и флуориметрии (см. SI Рис.6).

Благодарности

Эта работа была поддержана Канадским фондом кистозного фиброза и Канадскими институтами исследований в области здравоохранения. B.E.S. был поддержан Центром молекулярной медицины Маклафлина. С.Г. является нынешним руководителем кафедры клеточной биологии Питбладо.

Сноски

• ^¶ Кому корреспонденцию следует направлять по адресу:
  Программа
  по клеточной биологии, Больница для больных детей, 555 Юниверсити-авеню, Торонто, Онтарио, Канада M5G 1X8.

  Эл. Почта: sga {at} sickkids.ca

• Вклад авторов: B.E.S. и С.Г. разработали исследования; B.E.S., N.T. и M.V.-C. проведенное исследование; B. E.S., N.T., M.V.-C. и S.G. проанализировали данные; и B.E.S., N.T. и S.G. написали статью.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/cgi/content/full/0700783104/DC1.

• Сокращения:

  V-АТФаза,

  АТФаза вакуолярного типа;

  пмс,

  протонодвижущая сила;

  DiBAC4 (5),

  бис- (1,3-дибутилбарбитуровая кислота) пентаметиноксонол;

  DACCA,

  7-диэтиламинокумарин-3-карбоновая кислота;

  sRBC,

  овцы RBC;

  cFRET,

  исправленный FRET;

  ΨΦ,

  электрический потенциал, который развивается через фагосомную мембрану;

  PM,

  разность электрических потенциалов;

  FCCP,

  карбонилцианид 4- (трифторметокси) фенилгидразон.

• © 2007 Национальная академия наук США

Малый G-белок Rac1 активирует фосфолипазу Cδ1 через фосфолипазу Cβ2

Rac1, который связан с цитоскелетными путями, может активировать фосфолипазу Cβ2 (PLCβ2) для увеличения внутриклеточного Cβ2 (PLCβ2) Ca ²⁺ уровней. Этот увеличенный Ca ²⁺ может, в свою очередь, активировать очень надежный PLCδ1 для синергии сигналов Ca ²⁺ . Ранее мы обнаружили, что PLCβ2 будет связываться и ингибировать PLCδ1 в растворе с помощью неизвестного механизма и что комплексы PLCβ2 · PLCδ1 могут быть разрушены субъединицами Gβγ.Однако, поскольку основные популяции PLCβ2 и PLCδ1 являются цитозольными, их регуляция с помощью субъединиц Gβγ неясна. Здесь мы обнаружили, что домены гомологии плекстрина (PH) PLCβ2 и PLCβ3 являются областями, которые приводят к связыванию и ингибированию PLCδ1. В клетках PLCβ2 · PLCδ1 образуют комплексы, что видно по резонансному переносу энергии Фёрстера и коиммунопреципитации, а микроинъекция PHβ2 диссоциирует комплекс. Используя PHβ2 в качестве инструмента для оценки вклада PLCβ-ингибирования PLCδ1 в высвобождение Ca ²⁺ , мы обнаружили, что, хотя PHβ2 приводит только к 25% ингибированию PLCδ1 в растворе, в клетках присутствие PHβ2, по-видимому, устраняет Ca ^{2+ Выпуск} , предполагающий большой пороговый эффект.Мы обнаружили, что небольшая популяция плазматической мембраны PLCβ2 · PLCδ1 нарушается активацией гетеротримерных G белков, и что основная цитозольная популяция комплексов разрушается активацией Rac1. Таким образом, активность PLCδ1 контролируется количеством связанного PLCβ2, которое изменяется при замещении фермента гетеротримерными или маленькими G-белками. Через PLCβ2 активация PLCδ1 связана с поверхностными рецепторами, а также с сигналами, которые опосредуют цитоскелетные пути.

Кальций

Перенос энергии резонанса флуоресценции (FRET)

G Белки

Сигнал фосфатидилинозитола

Взаимодействия белок-белок

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

© 2010 ASBMB.В настоящее время опубликовано Elsevier Inc; Первоначально опубликовано Американским обществом биохимии и молекулярной биологии.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

CAY10603 — C22h40N4O6 — Bertin Bioreagent

Миссия

Cayman Chemical — помочь сделать исследования возможными, предоставив ученым во всем мире базовые инструменты исследования, необходимые для улучшения здоровья человека и животных. Наше главное обязательство перед исследователями в области здравоохранения — предлагать продукты высочайшего качества по доступной ценовой политике.

Наши ученые являются экспертами в синтезе, очистке и описании биохимических веществ, от небольших гетероциклов, подобных лекарствам, до сложных биолипидов, жирных кислот и многих других. Мы также обладаем высокой квалификацией во всех аспектах анализа и разработки антител, экспрессии белков, кристаллизации и определения структуры.

За последние тридцать лет на Каймановых островах накопилась обширная база знаний в области биохимии липидов, включая исследования, касающиеся каскада арахидоновой кислоты, инозитолфосфатов и каннабиноидов.Эти знания позволили производить реагенты исключительного качества для лечения рака, окислительного повреждения, эпигенетики, нейробиологии, воспалений, метаболизма и многих дополнительных направлений исследований.

Наши химики-органики и аналитики специализируются на быстрой разработке производственных процессов и аналитических методов для осуществления клинического и коммерческого производства GMP-API. В настоящее время проводятся доклинические исследования лекарств в областях восстановления и восстановления костей, мышечной дистрофии, онкологии и воспалений.Отдельная группа ученых с докторской степенью занимается предоставлением услуг по обнаружению и профилированию эпигенетических целей. Мы можем нанять наших опытных химиков для выполнения полного анализа проб аналитов, измеряемых в большинстве наших анализов. Мы также предлагаем широкий спектр аналитических услуг с использованием ЖХ-МС / МС, ВЭЖХ, ГХ и многих других методов.

Аккредитация
ISO / IEC 17025: 2005
ISO Guide 34: 2009

Кайман является лидером в области новых наркотиков, вызывающих злоупотребление, обеспечивая высокочистые контролируемые вещества Списка I-V лабораториям, имеющим федеральные лицензии, и квалифицированным академическим исследовательским учреждениям для проведения судебно-медицинских анализов.Мы сертифицированы Службой аккредитации ACLASS с двойной аккредитацией по ISO / IEC 17025: 2005 и ISO Guide 34: 2009.

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.
  Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г.,
  браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.
  Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie
потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт
не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к
остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Исследование связывания полимеразы семейства Y с ее целевой ДНК

Abstract

Распознавание белков и ДНК — это центральный биологический процесс, который определяет жизнь клеток. Белок часто претерпевает конформационный переход с образованием функционального комплекса со своей целевой ДНК. Ожидается, что конформационная динамика белка будет способствовать стабильности и специфичности распознавания ДНК и, следовательно, может контролировать функциональную активность комплекса белок-ДНК.Понимание того, как конформационная динамика влияет на распознавание ДНК-белок, по-прежнему является сложной задачей. Здесь мы разработали модель на основе структуры с двумя бассейнами для изучения функциональной динамики в ДНК-полимеразе IV семейства Y (DPO4) Sulfolobus solfataricus во время ее связывания с ДНК. С подробным рассмотрением неспецифических и специфических взаимодействий между DPO4 и ДНК мы обнаружили, что распознавание DPO4-ДНК состоит из сначала трехмерной диффузии, затем короткодействующей корректировки, скользящей по ДНК, и, наконец, специфического связывания.Интересно, что мы обнаружили, что DPO4 находится в конформационном равновесии между множественными состояниями во время процесса связывания, и распределение конформаций меняется на разных стадиях связывания. Модулируя силу электростатических взаимодействий, гибкость линкера и конформационную динамику в DPO4, мы нарисовали четкую картину того, как DPO4 динамически регулирует распознавание ДНК. Мы утверждаем, что уникальные особенности гибкости и конформационной динамики в распознавании DPO4-ДНК имеют прямое значение для синтеза ДНК с низкой точностью трансформации, большая часть которого, как было обнаружено, осуществляется ДНК-полимеразами Y-семейства. Наши результаты помогают завершить описание процесса синтеза ДНК для полимераз Y-семейства. Кроме того, разработанные здесь методы могут быть широко применены для будущих исследований того, как различные белки распознают и связывают определенные субстраты ДНК.

Сведения об авторе

Распознавание ДНК белков имеет решающее значение для многих ключевых биологических процессов в клетках. Белок часто претерпевает крупномасштабные конформационные изменения во время распознавания ДНК. Однако физическое и глобальное понимание гибкого связывания белка с ДНК все еще остается сложной задачей.Здесь мы разработали теоретический подход к исследованию связывания ДНК-полимеразы Y-семейства с ее целевой ДНК в процессе синтеза ДНК. Результаты контролируемого электростатикой многоступенчатого процесса связывания ДНК, сопровождаемого многоступенчатым конформационным переходом белка, происходящим повсюду, находятся в замечательном согласии с экспериментами. Обнаружено, что в процессе распознавания белок-ДНК гибкость облегчает как конформационный переход белка (внутрицепочечная динамика), так и связывание ДНК (межцепочечная динамика) одновременно.Поэтому мы предоставили количественное описание механизма связывания белок-ДНК, который гибкостью или конформационным изменением регулирует узнавание ДНК динамически, что приводит к высокой эффективности и специфичности функции распознавания белок-ДНК.

Образец цитирования: Chu X, Liu F, Maxwell BA, Wang Y, Suo Z, Wang H, et al. (2014) Динамическое изменение конформации регулирует распознавание ДНК-белка: исследование связывания полимеразы семейства Y с ее целевой ДНК. PLoS Comput Biol 10 (9):
e1003804.https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003804

Редактор: Александр Дональд МакКерелл, Мэрилендский университет, Балтимор, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 5 мая 2014 г .; Одобрена: 10 июля 2014 г .; Опубликовано: 4 сентября 2014 г.

Авторские права: © 2014 Chu et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Авторы подтверждают, что все данные, лежащие в основе выводов, полностью доступны без ограничений. Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: XC и FL выражают признательность за поддержку Национальному научному фонду Китая (гранты 211

, 11174105 и 114) и проекту 973 Китая (2010CB933600). ZS поддерживается грантом Национального научного фонда США (MCB-0960961). BAM был поддержан президентским стипендиатом в Университете штата Огайо.JW благодарит Национальный научный фонд за поддержку. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Распознавание ДНК белков имеет решающее значение для жизни клеток. Взаимодействия между белками и нуклеиновыми кислотами преобладают во многих жизненно важных процессах, включая синтез ДНК, транскрипцию генов, сборку и разборку хромосом и т. Д.Накапливаются доказательства того, что события узнавания белок-ДНК часто сопровождаются конформационными изменениями, которые способствуют образованию необходимого функционального комплекса [1], [2]. Неупорядоченные области с высоко заряженными остатками широко встречаются в ДНК-связывающих белках [3] и часто ответственны за конформационные изменения в белках во время распознавания ДНК [4]. Такой гибкий заряженный сегмент в белке склонен образовывать неспецифический комплекс с ДНК за счет обильных электростатических взаимодействий и, следовательно, облегчает распознавание ДНК за счет уменьшения размерности процессов поиска цели за счет скольжения по контуру ДНК [3], [5], [6]. Обнаружено, что распознавание белок-ДНК ускоряется этим феноменом «облегченной диффузии» [7] — [11]. Следовательно, образование функционального комплекса белок-ДНК должно претерпевать трансформацию от неспецифической диффузии к специфическому переходу. В настоящее время все большее количество структур ДНК-связывающих белков как в несвязанных, так и в связанных с ДНК формах определяется экспериментально с помощью рентгеновской кристаллографии. Иллюстрация различных структурных представлений белков со связыванием ДНК и без нее значительно улучшила наше понимание взаимодействий белок-ДНК [12].Установлено, что конформационные изменения или структурная гибкость обеспечивают множество преимуществ для биомолекулярного распознавания [13] — [17], включая быструю скорость ассоциации / диссоциации, большие дополнительные интерфейсы связывания, высокую специфичность связывания, сопровождаемую умеренным сродством связывания, и т. Д. -связывающие белки увеличивают подвижность для точной настройки сродства связывания [18], а также вносят вклад в стабильность и специфичность комплекса ДНК-белок [1], [4], [19].Однако до сих пор отсутствует информация о динамике механизмов связывания ДНК, а точнее, о роли гибкости или конформационной динамики в процессе формирования и реализации функций комплекса ДНК-белок.

ДНК-полимеразы

катализируют репликацию ДНК по ступенчатому механизму, начиная со специфического связывания с ДНК на репликационной вилке с последующим включением нуклеотида в зарождающуюся цепь ДНК. Полимеразы семейства Y представляют собой группу специализированных ДНК-полимераз, которые эволюционировали для облегчения репликации через различные повреждения ДНК, хотя они могут реплицировать неповрежденную ДНК с низкой точностью и плохой процессивностью [20].Несмотря на то, что полимеразы семейства Y имеют небольшую идентичность последовательностей с другими ДНК-полимеразами высокой точности, многочисленные структурные исследования показали, что полимеразы семейства Y сохраняют консервативную структуру ядра правой полимеразы, состоящую из большого пальца (Т), ладони. (P) и finger (F) домены, общие для всех ДНК-полимераз [21] — [23]. Кроме того, полимеразы семейства Y обладают уникальным доменом, связанным с ядром полимеразы, называемым доменом мизинца (LF) [21] или доменом, связанным с полимеразой (PAD) [22] — [24].Было обнаружено, что LF-домен является основным фактором, определяющим уникальные биохимические свойства различных полимераз Y-семейства [25], и вносит вклад в общую аффинность связывания с ДНК [21], [22]. Sulfolobus solfataricus ДНК-полимераза IV (DPO4) представляет собой модельную полимеразу семейства Y, которая широко изучена как со структурной, так и с кинетической точек зрения [26] — [28]. Апо-DPO4 и связанный с ДНК DPO4 обнаруживают очень разные структурные конформации [26], подразумевая, что во время распознавания DPO4-ДНК происходит конформационное изменение «открыто-закрыто».Сходные конформационные изменения были также выведены из кристаллических структур нескольких ДНК-полимераз Y-семейства человека [23], [29] — [32]. Исследования полимеризации ДНК в основном сосредоточены на стадиях каталитического процесса, связанного с включением нуклеотидов [33] — [40], которое является центральным этапом в синтезе ДНК. Однако недавнее исследование FRET с остановленным потоком показало, что распознавание и связывание ДНК — это сложный, многоступенчатый процесс, в котором стадии конформационных изменений могут происходить отдельно от полного образования специфического комплекса DPO4-ДНК [41].Тем не менее, четкое описание начального распознавания участка праймера-матрицы целевой ДНК ДНК-полимеразой и соответствующей конформационной динамики отсутствует. Предыдущие результаты экспериментов и моделирования дали убедительные доказательства того, что очень гибкий линкер, который соединяет T- и LF-домены, играет главную роль в этом конформационном переходе в DPO4 [26], [28], [42]. Как происходит связывание, а также как конформационная динамика и гибкий линкер участвуют в распознавании DPO4-ДНК, остаются неясными.

Здесь мы выполнили термодинамическое и кинетическое моделирование, чтобы изучить конформационные переходы DPO4 во время связывания с целевым сайтом в ДНК путем разработки структурной модели (SBM). Определенные типы SBM, удовлетворяющие принципу минимально фрустрированных энергетических ландшафтов [43], [44], были использованы для изучения биомолекулярных переходов сворачивания и связывания в сторону образования уникальной нативной структуры [45] — [49]. Основываясь на нашей предыдущей работе [50], [51], мы расширили простой SBM до двух бассейнового SBM с электростатическими взаимодействиями, описанными моделью Debye-Hcükel, стремясь уловить конформационную динамику DPO4 во время распознавания ДНК.Наши результаты ясно показали, что распознавание DPO4-ДНК включает трехмерную диффузию, затем короткодействующее регулирование, скользящее по ДНК, и, наконец, специфическое связывание. Конформационные изменения в DPO4 происходят на протяжении всего процесса связывания, с разными стадиями, представляющими разные конформационные распределения. Конформационная динамика DPO4, по-видимому, регулируется ДНК. Между тем разные конформации DPO4 по-разному влияют на кинетику связывания ДНК. Мы также обнаружили, что электростатические взаимодействия, с одной стороны, способствуют трехмерной диффузии в качестве «управляющих сил» [15], [52] — [54], а с другой стороны, препятствуют скольжению на коротких расстояниях по ДНК из-за образования неродных кинетических ловушки.Эффективность специфического распознавания DPO4-ДНК определяется взаимодействием между несколькими стадиями связывания. В частности, мы отмечаем, что гибкость положительно заряженного линкера не только способствует конформационному распределению в DPO4, но также отвечает за стабилизацию неспецифического комплекса и, следовательно, имеет решающее значение для распознавания DPO4-ДНК. Наши методы, с явным учетом неспецифических и специфических взаимодействий между DPO4 и ДНК, предоставляют подробное описание процесса связывания DPO4 с его целевой ДНК.Эта работа иллюстрирует процесс распознавания специфических белков-ДНК и сопутствующую конформационную динамику и, таким образом, обогащает наше понимание каталитического механизма полимеризации ДНК.

Результаты

DPO4 динамически связывается с ДНК

Без связывания с ДНК кристаллическая структура DPO4 присутствует в виде состояния «Apo» (A-состояние) (рис. 1A), которое сильно отличается от конформации, наблюдаемой в состоянии, связанном с ДНК (B-состояние) (рис. 1С) [21], [26].Основное различие в A- и B-состояниях DPO4 заключается в расположении и ориентации LF-домена относительно F, P и T-доменов и складчатости неупорядоченной области в F-домене, в то время как другие отдельные домены не показывают значительные конформационные изменения. Следовательно, DPO4 претерпевает типичный конформационный переход «от A к B», связанный со сворачиванием неупорядоченной петли в F-домене во время связывания с ДНК.

Рисунок 1. Структурное представление ландшафтов DPO4 и свободной энергии.

Структура A-, I- и B-состояний DPO4 показана на (A), (B) и (C), окрашенными: доменом F, синим; область P, красный цвет; домен Т, зеленый; домен LF — фиолетовый; линкер между доменами LF и T, серый. Конкретные взаимодействия, образованные LF-доменом с T-доменом в A-состоянии и F-доменом в B-состоянии, показаны оранжевыми линиями в (A) и (C), а количество конкретных взаимодействий указано в круглые скобки соответственно. Неструктурированная петля в F-области показана синими пунктирными линиями на (A) и (B).(D) Свободная энергия связи показана как функция Q _iDNA и D _COM ат. Q _iDNA описывает естественное сходство связывания DPO4 с ДНК, D _COM описывает расстояние между DPO4 и ДНК. Четыре минимума свободной энергии соответствуют различным стадиям связывания: US, EC, IS и BS. Было выполнено моделирование постоянной температуры при температуре, и показана траектория для подтверждения непрерывности смежных стадий в ландшафтах свободной энергии.(E – H) Ландшафты свободной энергии конформационной динамики в DPO4 показаны как функция Q _A и Q _iB на каждой стадии связывания. Q _A , Q _iB измеряет естественное сходство LF-домена, взаимодействующего с T-доменом в A-состоянии и F-доменом в B-состоянии, соответственно. A-, I- и B-состояния DPO4 можно наблюдать в США, ЕС и IS с различным распределением популяции на разных стадиях связывания.В BS можно наблюдать только I- и B-состояния DPO4. Населенности трех состояний DPO4 в каждом состоянии связывания представлены в виде круговых диаграмм на (D) около соответствующих минимумов свободной энергии.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003804.g001

Чтобы исследовать связывание DPO4 с ДНК, мы построили 2D-пейзажи свободной энергии вдоль Q _iDNA и D _COM взяты образцы. по Replica Exchange Molecular Dynamics (REMD) [55] (рис. 1D). Q _iDNA — это доля нативных контактов между DPO4 и ДНК, а D _COM — это расстояние центра масс между DPO4 и ДНК. Q _iDNA и D _COM являются координатами реакции связывания, которые контролируют степень процесса связывания. Пейзажи свободной энергии в сочетании с дополнительной траекторией моделирования постоянной температуры показали, что связывание DPO4-ДНК протекает с четырьмя кинетически связанными стадиями, включая стадию с несвязывающими состояниями (US), стадию с комплексом встречи (EC), стадию с промежуточными состояниями ( IS) и стадия со состояниями связывания (BS), соответствующая типичному биомолекулярному распознаванию [56].Подробно мы обнаружили, что DPO4 претерпевает конформационную динамику на каждой стадии во время распознавания ДНК из ландшафтов свободной энергии вдоль Q _A и Q _iB (рис. 1E – H), где Q _A и Q _iB — это доли собственных междоменных контактов LF-домена в A- и B-состоянии DPO4, соответственно. Существует три минимума свободной энергии для конформационной динамики DPO4, соответствующих состоянию с междоменными взаимодействиями, формирующимися между LF и T доменом (A-состояние, Q _A > 0. 8, Q _iB = 0), состояние с формированием междоменных взаимодействий между LF и F доменами (B-состояние, Q _A = 0, Q _iB > 0,8), и промежуточное состояние, в котором домен LF не взаимодействует с доменом F или T (I-состояние, рисунок 1B, Q _A <0,1, Q _iB <0,1).

Изучая сворачивание гибкой петли в F-домене, мы обнаружили, что переход петли от беспорядка к порядку можно наблюдать во время распознавания ДНК (рис. S6A в тексте S1).Петля в несвязанном состоянии, как показано, находится под быстрым динамическим переходом конформационной циркуляции, включая широкий спектр обильных неупорядоченных структур из-за небольшого барьера свободной энергии между ними (Рисунок S6B в тексте S1). Это наблюдение, что неупорядоченная область не полностью, а динамически неупорядочена, широко было замечено в исследованиях внутренне неупорядоченных белков (IDP) [57] — [60]. Ожидается, что он принесет пользу IDP за счет высокой специфичности связывания, но умеренной аффинности и быстрой кинетики [61].Мы обнаружили, что степень связывания LF-домена с F-доменом сильно связана с порядком петли в F-домене (рисунок S6A в тексте S1) и может использоваться для измерения степени формирования порядка в этом домене. петля.

Ландшафты свободной энергии конформационной динамики DPO4 убедительно доказали, что этот переход «от A к B» в DPO4 происходит в последовательности «A–> I–> B» через неизбежное I-состояние во время связывания DPO4 с ДНК (рис. 1E – H). Мы обнаружили, что на каждой стадии связывания (US, EC, IS или BS) DPO4 находится в конформационном равновесии между A-, I- и B-состояниями.Распределение населения трех состояний DPO4 различается на разных этапах связывания. При температуре моделирования (температура выражается в единицах энергии путем умножения постоянной Больцмана k и представляет собой силу дальнодействующего потенциала Леннарда-Джонса) в США A-состояние занимает самую высокую популяцию — 54,1%, I- В штате немного меньше населения — 45,7%, а в штате В — лишь небольшую часть населения — 0,2%. По мере того, как связывание проходит через стадии EC и IS, популяция A-состояния увеличивается, а I-состояние уменьшается, в то время как популяция B-состояния остается небольшой.Однако на последней стадии перехода от IS к BS населенности трех состояний DPO4 значительно изменяются, показывая, что можно наблюдать только I-состояние и B-состояние, а B-состояние является доминирующим. В целом, ландшафты свободной энергии показали, что распознавание DPO4-ДНК представляет собой многоступенчатый процесс связывания через четыре различных этапа связывания (США, ЕС, IS и BS), сопровождаемый конформационным переходом с несколькими состояниями между тремя различными состояниями DPO4 (A -, I- и B-состояния), встречающиеся повсюду.При распознавании DPO4-ДНК четыре стадии связывания описывают межцепочечную динамику процесса связывания ДНК, в то время как три состояния описывают внутрицепочечную динамику конформационного перехода в DPO4. Эти результаты обеспечивают динамическую картину распознавания DPO4-ДНК с одновременными изменениями межцепочечных взаимодействий и корректировками внутрицепочечных конформаций.

Температура регулирует конформационную динамику DPO4 во время связывания ДНК

Для дальнейшего изучения конформационной динамики DPO4 во время распознавания ДНК мы провели исследования температурной зависимости.Для США, ЕС и IS повышение температуры приводит к уменьшению населения A-состояния, увеличению населения I-состояния и почти неизменному населению B-состояния, которое близко к 0; в то время как для BS повышение температуры приводит к уменьшению заселенности B-состояния, увеличению заселенности I-состояния и почти неизменной заселенности A-состояния, которое близко к 0 (Рисунок 2). Результаты показали, что A- и B-состояния DPO4 управляются энтальпией и предпочтительны при низких температурах, в то время как I-состояние DPO4 определяется энтропией и благоприятно при высоких температурах.Стоит отметить, что температура здесь не может быть точно такой же по величине, что и температуры, при которых DPO4 обычно исследуется экспериментально из-за крупнозернистой особенности нашей модели. Было обнаружено, что DPO4 функционирует in vivo при экстремальных условиях 80 ° C и pH 2–3 [62]. Наше предыдущее моделирование сворачивания / разворачивания позволило сделать вывод, что при функциональной температуре конформация DPO4 имеет тенденцию изменяться на границе T- и LF-доменов, а также в линкерной области [28], что приводит к образованию I- состояние.Здесь мы обнаружили, что DPO4 выполняет распознавание ДНК с определенными популяциями DPO4 со структурой I-состояния в США и что популяция в I-состоянии значительно увеличивается с повышением температуры. В BS DPO4 в B-состоянии преобладает в широком диапазоне температур с небольшими популяциями DPO4 в I-состоянии. Следовательно, ожидается, что активность DPO4 будет поддерживаться при изменении температуры. Результаты согласуются с экспериментальными данными о том, что механизм DPO4 не зависит от температуры [27], [35], [63].Чтобы исследовать конформационную динамику узнавания ДНК, мы выбрали температуру (), при которой популяции A- и I-состояния DPO4 в США схожи, в то время как B-состояние DPO4 преобладает в BS до гарантия каталитической эффективности. Из-за наблюдения DPO4 в I-состоянии ожидается, что эта температура будет выше, чем комнатная температура, при которой DPO4 был экспериментально идентифицирован как имеющий структуру A-состояния [26], но ниже, чем общая температура плавления, поскольку мы сделали не наблюдать глобальный переход DPO4 в складывание / разворачивание во время моделирования.

Рис. 2. Конформационная динамика изменения DPO4 с температурой.

Распределение населения в A- (красные линии), I- (зеленые линии) и B-состоянии (синие линии) в (A) США, (B) EC, (C) IS и (D) BS: показано как функция температуры. Температура — это единица энергии ().

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003804.g002

Связывание DPO4 с ДНК — это переходный процесс от неспецифического к специфическому распознаванию

При распознавании DPO4-ДНК EC образуется после трехмерной диффузии, при которой теряется большая энтропия трансляции. Чтобы достичь минимума свободной энергии в EC, должны быть некоторые стабилизирующие взаимодействия между DPO4 и ДНК [64]. Однако в ЭК наблюдаются небольшие нативные взаимодействия, как показано на ландшафтах свободной энергии с Q _iDNA <0,1 (рис. 1D), что подразумевает, что стабилизирующие силы в ЭК в основном неродные. Изучая энергию межцепочечного взаимодействия DPO4-ДНК во время связывания (таблица 1), мы обнаружили, что существует много ненативных электростатических взаимодействий в EC, в то время как нативные взаимодействия почти не сформированы.Следует отметить, что неродные взаимодействия Леннарда-Джонса (LJ) представлены только исключительным термином отталкивания объема, который не способствует стабилизации ЭК (см. Подробности в « Материалы и методы » и текст S1 ). Таким образом, ЭК стабилизируется за счет многочисленных неместных электростатических взаимодействий. Межцепочечные электростатические взаимодействия рассматриваются как «управляющие силы» для облегчения биомолекулярного распознавания на первой стадии и затем для стабилизации временного частичного связывания ЕС для компенсации потери энтропии [15], [52] — [54].Таким образом, переход от США к ЕС облегчается ненативными электростатическими взаимодействиями и, как ожидается, будет неспецифическим. Трехмерную диффузию можно рассматривать как неспецифическое связывание.

Выводы о том, что ЭК стабилизируется ненативными электростатическими взаимодействиями, согласуются с предыдущим структурным анализом [19], [65], [66]. Здесь мы ввели алгоритм отсечения, который может учитывать неродные взаимодействия для исследования неродных контактов в ЕС.Для DPO4 ненативные контакты полностью формируются в LF-домене и линкерной области, в то время как другие домены, по-видимому, находятся далеко от ДНК (Рисунок 3A и Рисунки S7 и S8 в тексте S1). В частности, области с наиболее сильными взаимодействиями в DPO4 расположены у линкера и хвостов LF-домена. Обе эти области очень гибкие, что приводит к большому радиусу захвата. В дополнение ко многим положительно заряженным остаткам, присутствующим в этих двух областях, связывание белка с ДНК, как ожидается, будет облегчаться за счет механизма «закидывания мух» за счет гибкости и электростатических взаимодействий [13], [15], [16].Наши результаты моделирования подтверждают, что домен LF и линкер в DPO4 являются областями узнавания для связывания DPO4-ДНК, как наблюдали экспериментально [21], [22]. Для ДНК праймер / матрица имеется больше контактов, расположенных на одной стороне двухцепочечного дуплекса, состоящего из малой бороздки нативного распознавания и неродной большой бороздки, чем на другой стороне, состоящей из большой бороздки нативного распознавания. Это означает, что DPO4 избирательно перемещается по ДНК в ЭК. В частности, хотя DPO4 принимает три разные конформации в EC, карты контактов для трех состояний очень похожи, а значения энергии взаимодействий близки друг к другу (таблица S1, рисунки S7 и S8 в тексте S1).Стоит отметить, что DPO4 в B-состоянии имеет несколько более широкое и более сильное распределение ненативных контактов с ДНК, подразумевая, что DPO4 сильнее взаимодействует с ДНК в B-состоянии, чем в A- и I-состояниях. Однако на этой стадии очень малая популяция DPO4 в B-состоянии, поэтому ожидается, что эффект будет минимальным.

Рис. 3. Контакты между DPO4 и ДНК в ЭК.

Контакт основан на алгоритме отключения (см. Подробности в тексте S1). (A) Показаны средние значения контактов каждого остатка в DPO4 и окрашенная в контакт структура DPO4.Поскольку в ядре полимеразы не образуются контакты, показаны только LF-домен и линкер. Цвет на оси x представляет различные домены или области в DPO4, схема окраски такая же, как на рисунке 1A. (B) Средние контакты каждого нуклеотида в ДНК показаны отдельно для цепи праймера и матрицы. Цвет на оси абсцисс представляет различные области дуплекса ДНК: оранжевый — большая бороздка нативного распознавания; оливковый, родное признание малой канавки; темно-голубой, естественная область распознавания на конце ДНК. Нативные контакты показаны на рисунке 9. (C) ДНК окрашена средними контактами сахара, основания и фосфатной группы. Цвет в структуре на (A) и (C) от синего до красного соответствует количеству контактов от нуля до наибольшего.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003804.g003

После неспецифической ЭК, IS формируется за счет специфического связывания как электростатическими, так и неэлектростатическими нативными контактами (Таблица 1). Изучая нативные контакты в IS (рис. 4), мы обнаружили, что домен LF и линкер в DPO4 образуют почти все нативные контакты с ДНК, в то время как домены F, P и T образуют очень мало нативных контактов.Следовательно, нативные контакты в IS очень похожи в трех состояниях DPO4 (рис. S9 и S10 в тексте S1), подразумевая, что конформационная динамика DPO4 мало влияет на взаимодействия с ДНК на этой стадии связывания. Наши результаты показали, что в IS домен LF и линкер в DPO4 уже находятся в состоянии нативного связывания, а затем последняя стадия связывания, по-видимому, включает связывание других доменов DPO4 с целевыми сайтами на ДНК. С другой стороны, нативные контакты в большой бороздке дуплекса ДНК почти сформированы.Между тем, половина нативных контактов на конце цепи матрицы ДНК формируется, в то время как нативные контакты не образуются в малой бороздке дуплекса ДНК. Это согласуется с тем фактом, что большая бороздка ДНК обычно является первичным сайтом связывания [67], [68]. Стоит отметить, что электростатические взаимодействия, включая естественные и чужеродные, очень похожи в IS и BS, в то время как основное различие заключается в формировании собственных контактов LJ, энергия которых показывает заметное увеличение в BS.Это означает, что DPO4 завершает формирование всех естественных электростатических взаимодействий в IS, и последний этап эволюции от IS к BS является неэлектростатическим, специфическим связыванием и, как ожидается, будет электростатически независимым.

Рис. 4. Нативные контакты между DPO4 и ДНК, а также структурные иллюстрации комплекса DPO4-ДНК в IS.

(A) Показаны средние межцепочечные нативные контакты для каждого остатка в DPO4. Доля собственных контактов, которая измеряет степень образования собственных контактов, показана на рисунке вставки.(B) Доля нативных контактов показана для каждого нуклеотида либо праймера, либо цепи матрицы. Цвет по оси x на (A) и (B) такой же, как на рисунке 3. (C) Показаны типичные структуры A-, I- и B-состояний связывания DPO4 с ДНК в IS. . Стратегия окраски для DPO4 такая же, как на рисунке 1A.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003804.g004

Таким образом, процесс связывания DPO4-ДНК сильно отличается на разных этапах и включает переключение от неспецифического связывания к специфическому.Во-первых, DPO4 подвергается трехмерной диффузии, управляемой притягивающими электростатическими взаимодействиями на большие расстояния между ДНК и LF-доменом, а также линкером DPO4 с образованием неспецифических EC с ДНК; затем переход к IS происходит через специфические электростатические и LJ взаимодействия между ДНК и LF доменом, а также линкером DPO4; наконец, DPO4 формирует нативное связывание с ДНК посредством специфических взаимодействий LJ, включая связывание ДНК с доменами F, P и T.

Электростатические взаимодействия через концентрации солей модулируют кинетику связывания шаг за шагом

Термодинамические результаты подразумевают, что электростатические взаимодействия играют очень важную роль в процессе распознавания DPO4-ДНК, включая стабилизацию EC с неспецифическими взаимодействиями и эволюцию к IS от EC со специфическими взаимодействиями.Чтобы исследовать роль электростатических взаимодействий в кинетике распознавания, мы проанализировали среднее время прохождения (MPT) при различных концентрациях соли, соответствующих разной силе электростатических взаимодействий (рис. 5). В модели Дебая-Хюкеля эффект концентрации соли модулируется длиной радиуса Дебая. С увеличением концентрации соли экранирующий эффект неявного иона увеличивается, что приводит к снижению силы электростатических взаимодействий.

При уменьшении концентрации соли (увеличении электростатических взаимодействий) мы обнаружили, что скорость трехмерной диффузии из США в ЕС увеличивается до 3 раз, подразумевая, что электростатические взаимодействия облегчают связывание на ранней стадии.Это согласуется с термодинамическим анализом, и предполагается, что электростатические взаимодействия являются «управляющими силами» в биомолекулярном распознавании [15], [52] — [54]. Интересно то, что мы обнаружили, что увеличение электростатических взаимодействий неблагоприятно сказывается на переходе от EC к IS, поскольку уменьшение концентрации соли привело к замедлению кинетики более чем на два порядка. Поскольку переход от EC к IS включает формирование специфических электростатических взаимодействий, отрицательная корреляция между скоростью связывания и силой электростатических взаимодействий была неожиданной.Из нашего термодинамического анализа мы обнаружили, что существует широкое распространение ненативных электростатических взаимодействий, образованных в ЭК, из-за заряженных характеристик системы DPO4-ДНК. Ненативные взаимодействия снижают размерность связывания DPO4 с 3D в США до 1D в ЕС, что приводит к эффективному поиску конкретного целевого сайта на ДНК. Однако эти прерывистые, преходящие, неродные взаимодействия могут привести к кинетическим ловушкам на энергетическом ландшафте, замедляющим связывание. Недавно Marcovitz и Levy исследовали взаимодействие между неспецифическим и специфическим связывающими способами распознавания белок-ДНК, принимая во внимание структуры белков и ДНК [69], [70].Они предположили, что между двумя режимами связывания существует умеренная степень разочарования. Это расстройство, которое регулирует распознавание белок-ДНК, коррелирует с перекрытием между участками неспецифического и специфического связывания. Низкое разочарование приведет к жесткому энергетическому ландшафту для неспецифического связывания, но быстрому переходу от неспецифического связывания к специфическому. Напротив, сильное разочарование приведет к гладкому ландшафту для скольжения, но высокому барьеру свободной энергии для неспецифического по отношению к специфическому связыванию [69], [70].В действительности предполагается, что степень нарушения связывания белок-ДНК должна быть оптимизирована для удовлетворения биологической функции. При распознавании DPO4-ДНК переход от неспецифического EC к специфическому IS включает переключение электростатических взаимодействий с неспецифических на специфические, что приводит к расстройству или возникновению барьера свободной энергии. Увеличение электростатических взаимодействий увеличит это расстройство между двумя режимами связывания, что приведет к снижению скорости распознавания. На последнем этапе кинетическая скорость не зависела от концентрации соли, что согласуется с термодинамическим анализом, согласно которому переход от IS к BS не связан с электростатическими взаимодействиями.

При низкой концентрации соли переход от EC к IS является этапом, ограничивающим скорость распознавания DPO4-ДНК. С увеличением концентрации соли скорость корректировки DPO4 на ДНК увеличивается, и последняя стадия перехода от IS к BS становится лимитирующей стадией. Следовательно, эффективность распознавания DPO4-ДНК не может быть увеличена за счет электростатических взаимодействий, особенно в случае низких концентраций соли, при которых кинетика связывания будет замедляться заряженными взаимодействиями из-за очень стабильной неспецифической ЭК.

Гибкость линкера облегчает распознавание за счет повышения эффективности неспецифического по отношению к специфическому связыванию

Во время конформационного перехода из A- в I-состояние в DPO4, линкерная область между T- и LF-доменами значительно изменяется, это означает, что линкер очень гибкий [26], [42]. Гибкость линкера подтверждена экспериментами по тепловой денатуризации [27]. Из нашего термодинамического анализа мы обнаружили, что линкер является важной частью области начального распознавания в связывании DPO4-ДНК в EC и является стабилизирующим сегментом в IS. Таким образом, важно исследовать роль гибкости линкера во время распознавания ДНК. В нашем SBM конформация притягивается к естественной структуре, соответствующей бассейну энергетических ландшафтов. Поскольку в нижней части энергетической воронки есть два бассейна, мы выполнили две группы моделирования, в которых конформации линкера притягиваются к A-состоянию и структуре B-состояния отдельно, с разными параметрами масштабирования. контролирует жесткость линкера, смещенного в A-состояние или B-состояние в нашей модели, а небольшое (большое) значение соответствует низкой (высокой) жесткости.(Подробности в « Материалы и методы »).

Гибкость линкера и смещение в A- или B-состояние мало влияет на этапе трехмерной диффузии из США в ЕС (рис. 6A). По мере связывания мы обнаружили, что переход от EC к IS ускоряется гибкостью линкера. Это может быть связано с тем, что гибкий линкер ускользает из ловушек ненативных взаимодействий легче, чем жесткий, когда DPO4 выполняет регулировку ближнего действия, скользящую по ДНК.Примечательно, что при низкой гибкости (высокой) линкер, смещенный в B-состояние, демонстрирует более медленную кинетику связывания, чем при смещении в A-состояние. Другими словами, переход от EC к IS неблагоприятно влияет на B-состояние линкера. Результаты могут быть объяснены картой контактов в EC (рис. S7 и S8 в тексте S1), в которой DPO4 в B-состоянии имеет более широкие и более сильные ненативные электростатические взаимодействия с ДНК, чем в A- и I-состояниях. . Смещение линкера в B-состояние увеличивает относительную популяцию DPO4 в B-состоянии (рис. 6B), что приводит к более стабильному захвату EC.Следовательно, для достижения высокой эффективности скольжения по основной цепи ДНК требуется гибкий, а не жесткий линкер в DPO4.

Обнаружено, что смещение линкера в B-состояние или A-состояние значительно благоприятствует или не способствует последнему этапу связывания, соответственно (фиг. 6A). Связывание IS с BS соответствует специфическому связыванию F, T и P домена DPO4 с целевым сайтом на ДНК, сопровождающимся образованием B-состояния DPO4. Хотя три состояния в DPO4 не показывают различий в межцепочечных взаимодействиях с ДНК в IS (рис. S9 и S10 в тексте S1), сильно смещающий линкер в B-состояние способствует конформационному переходу «A в B» в DPO4 ( Рисунок 6B), и ожидается, что он увеличит скорость от IS к BS.Кроме того, когда линкер сильно смещен в сторону B-состояния, этап ограничения скорости изменяется на переход от EC к IS, что соответствует процессу трансформации от неспецифического связывания к специфическому.

Динамика DPO4 регулирует кинетику распознавания

Во время связывания ДНК DPO4 находится в конформационном равновесии между A-, I- и B-состояниями. Чтобы исследовать, как эта конформационная динамика в DPO4 влияет на связывание ДНК, мы масштабировали силу смещения в сторону структуры B-состояния в нашем SBM и рассчитали кинетику связывания (рис. 7A).- параметр масштабирования, который контролирует силу конкретных взаимодействий в B-состоянии DPO4. Большой (маленький) соответствует сильным (слабым) специфическим взаимодействиям в B-состоянии DPO4. Увеличение приводит к более населенному B-состоянию DPO4, и популяция A- и I-состояния DPO4 соответственно уменьшается (Рисунок 7B).

Рисунок 7. MPT изменяется с конформационной динамикой.

— это сила специфических нативных контактов между LF и F доменами в B-состоянии DPO4.контролирует конформационную динамику DPO4. (A) MPT как функция от. (B) Конформационное распределение A-, I- и B-состояний DPO4 в США, ЕС, IS и BS с разными. Полоса ошибок представляет собой стандартную ошибку соответствующего MPT.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003804.g007

Интересно, что конформационная динамика мало влияет на трехмерную диффузию США в ЕС, поскольку три состояния DPO4 заякоривают молекулы ДНК с одинаковой скоростью ( Рисунок 7A).Было обнаружено, что при переходе от ЭК к IS скорость замедляется за счет увеличения. Это связано с тем, что увеличение приводит к более высокому уровню популяции B-состояния DPO4 в ЭК, а сильные взаимодействия B-состояния DPO4 с ДНК замедляют короткодействующую кинетику регулирования за счет образования кинетических ловушек. Наконец, B-состояние DPO4 облегчает переход IS к BS по мере увеличения. Шаг ограничения скорости изменяется в зависимости от значения. В малых количествах связывание DPO4-ДНК ограничивается последним специфическим переходом от IS к BS.Чем выше, тем выше скорость перехода от IS к BS, в то время как скорость перехода от EC к IS уменьшается и становится ограничивающей скорость. Оптимальный случай соответствует диапазону от 1,5 до 2,0, при котором скорости перехода от EC к IS и от IS к BS одинаковы, а общая скорость связывания является самой высокой.

Обсуждение

Используя спектроскопию кругового дихроизма и экспериментальную технологию теплового сканирования на основе флуоресценции, Sherrer et al. наблюдали разворачивающийся промежуточный продукт при повышении температуры с 26 до 119 ° C [27].В нашем моделировании DPO4-ДНК здесь мы обнаружили I-состояние DPO4 во время распознавания ДНК в дополнение к A- и B-состояниям DPO4. Структурная характеристика I-состояния DPO4, который имеет гибкий и протяженный линкер и четыре хорошо свернутых домена (за исключением неструктурированной петли в F-домене), согласуется с разворачивающимся промежуточным звеном, обнаруженным с помощью как экспериментальных измерений, так и наших предыдущих имитационное исследование сворачивания и разворачивания DPO4 [27], [28].

Связывание влияет на конформационные изменения

Наш анализ показал, что DPO4 находится в конформационном равновесии между A-, I- и B-состояниями во время процесса связывания ДНК с различным распределением популяций на каждой стадии.Поскольку анализ контактной карты показал, что межцепочечные взаимодействия трех состояний DPO4 с ДНК очень похожи, ожидается, что эффект связывания ДНК будет модулировать конформационное равновесие DPO4 посредством энтропии. По мере связывания пространство конформационного поиска для конформационной динамики DPO4 значительно сокращается из-за пространственного ограничения, что приводит к тому, что связывание способствует низкоэнтальпийному и низкоэнтропийному A-состоянию или B-состоянию, а не высокоэнтальпийному. и высокоэнтропийное I-состояние.Более подробно, поскольку связывание происходит перед окончательной BS, популяции A- и I-состояний увеличиваются и уменьшаются соответственно; в BS в B-состоянии преобладает умеренное население I-состояния. Структурно взаимодействия между LF и T доменами в A-состоянии DPO4 блокируют ДНК-связывающую щель, тем самым предотвращая образование A-состояния в BS. Следовательно, переход IS к BS требует распутывания контактов между LF и T доменами в A-состоянии DPO4, что является трудоемким процессом.При умеренных концентрациях соли мы обнаружили, что последняя стадия, состоящая из специфического связывания DPO4 с ДНК в сочетании с конформационным переходом в B-состояние DPO4, является лимитирующей стадией в распознавании DPO4-ДНК. По сравнению с B-состоянием DPO4, I-состояние DPO4 в BS имеет более слабые межцепочечные взаимодействия с ДНК (Таблица S1 в тексте S1) и более протяженную конформацию, что приводит к большей доступной для растворителя области при связывании ДНК. сайт. Следовательно, конформационное равновесие DPO4, находящегося в BS, приведет к колебаниям взаимодействий между DPO4 и субстратом ДНК, что может способствовать способности DPO4 приспосабливаться к обходу различных повреждений ДНК [71] — [74], одновременно внося вклад в низкая точность синтеза ДНК, характерная для ДНК-полимераз Y-семейства.Было бы интересно исследовать, как наличие различных повреждений в субстрате ДНК может влиять на процесс узнавания DPO4-ДНК.

Гибкость линкера

Гибкость линкера, который способствует промежуточному состоянию разворачивания во время экспериментов по разворачиванию [27], демонстрирует, что играет очень важную роль в распределении конформационных состояний в DPO4 в нашем моделировании. Кроме того, было обнаружено, что гибкий линкер со многими положительно заряженными остатками является «элементом молекулярного распознавания (MoRE)» в связывании DPO4-ДНК и, следовательно, контролирует эффективность распознавания.В наших предыдущих моделированиях и экспериментах было обнаружено, что гибкие линкеры в многодоменных белках способствуют распознаванию ДНК за счет диффузии в уменьшенном измерении [5], [75]. Основываясь на анализе карты контактов, мы обнаружили, что гибкий линкер образует множество ненативных электростатических взаимодействий в ЭК. Это указывает на то, что линкер, особенно MoRE, отвечает за переключение режимов связывания с трехмерной диффузии на короткодействующее регулирование, скользящее по ДНК, что соответствует «облегченной диффузии» [7] — [11].Кроме того, мы обнаружили, что переход от EC к IS ускоряется, поскольку линкер становится более гибким. Ожидается, что неспецифические EC будут динамически упорядочены из-за высокой гибкости линкера, что приведет к «нечетким комплексам» [76], [77]. Колеблющаяся форма EC со слабой силой взаимодействий позволяет осуществлять быстрый поиск вблизи репликационной вилки, чтобы позволить DPO4 найти целевой сайт праймера-матрицы для достижения адаптивности распознавания [4], [19].

Эксперименты по связыванию DPO4 с ДНК

Противоречивые экспериментальные данные, полученные с помощью различных методик [36], [39], [41], [78], [79], показали, что процесс ассоциации и диссоциации комплекса DPO4-ДНК сложен, и механизм связывания ДНК остается неуловимым.Наши результаты могут дать новое понимание этого механизма и могут помочь связать экспериментальные результаты из различных исследований [36], [78], [79]. Первоначальный кинетический анализ на основе ³² P показал, что высвобождение ДНК из комплекса DPO4-ДНК является лимитирующим по скорости при стационарном катализе с наблюдаемой скоростью диссоциации 0,02 с ^-1 [78]. Однако это значение на три порядка ниже скорости диссоциации, измеренной по изменениям флуоресценции мутанта DPO4 Trp, который, как было показано, обладает полной каталитической активностью [36].Наши результаты демонстрируют, что распознавание DPO4-ДНК представляет собой процесс с несколькими состояниями, и вышеупомянутые очень разные скорости диссоциации могут происходить на разных стадиях высвобождения ДНК. Как показано на рисунке 8, скорости различных стадий диссоциации значительно различаются. При переход от BS к IS происходит быстрее, чем переход от специфического сложного IS к неспецифическому сложному EC. После образования ЭК DPO4 может легко высвобождать ДНК с максимальной скоростью. Таким образом, диссоциация, измеренная в стационарном кинетическом анализе, может соответствовать процессу потери определенного комплекса, включая переход от BS к IS, а затем от IS к EC.В анализах, основанных на флуоресценции, флуоресценцию контролировали по T239W в линкерной области. В нашем моделировании мы обнаружили, что линкерная область образует множество неродных контактов с ДНК в EC, где полярность локального окружения Trp-239 отличается от таковой в США. Следовательно, скорость диссоциации, измеренная с помощью этого флуоресцентного подхода, вероятно, описывает переход от EC к US, который, как показано здесь, намного быстрее, чем переход от BS к EC.Кроме того, стационарный кинетический анализ показал, что при повышении температуры с 37 ° C до 56 ° C скорость диссоциации ДНК увеличивается с 0,02 с ^-1 до 0,11 с ^-1 [35] . Это согласуется с нашими результатами на рисунке 8, которые показывают, что скорость диссоциации ДНК от специфических BS и IS к неспецифическим EC увеличивается с увеличением температуры. Интересно, что недавнее исследование FRET одной молекулы [79] измеряет скорость диссоциации DPO4-ДНК, которая является промежуточной между значениями, определенными кинетическими методами на основе ³² P [78] и флуоресценцией Trp [36].Это могло быть результатом измерения диссоциации смеси комплексов на стадиях EC, IS и BS. Примечательно, что в этом исследовании FRET одной молекулы [79] авторы наблюдали множественную эффективность FRET для бинарного комплекса DPO4-ДНК, которую они приписали предварительно перемещенному комплексу, соответствующему бинарному комплексу, наблюдаемому в кристаллических структурах, и перемещенному комплексу, где DPO4 сместил свои контакты с ДНК на одну пару оснований вдоль спирали ДНК. Однако в свете наших исследований возможно, что разные уровни эффективности FRET могут быть частично связаны с разными конформациями DPO4 в A-, I- или B-состоянии в EC, IS или BS.

Механизм связывания: индуцированная подгонка в сравнении с конформационным отбором

Механизмы связывания долгое время обсуждались при биомолекулярном распознавании. Модель жесткого связывания, называемая механизмом «замок и ключ», была предложена Фишером более века назад [80] и успешно объяснила ферментативную реакцию, катализируемую жестким комплементарным субстратом. Принимая во внимание гибкость биомолекулярного распознавания, появились два дополнительных предложения: «индуцированное соответствие» [81] и «конформационный отбор» [82] — [87].Два сценария связывания различаются по тому, происходят ли конформационные изменения до или после связывания. Механизм связывания с индуцированной подгонкой был предложен для распознавания белок-ДНК из-за дальнодействующих электростатических взаимодействий и геометрического размера ДНК [88], [89]. Однако наше недавнее исследование FRET с остановленным потоком с DPO4 показывает, что конформационные изменения происходят на стадии, отличной от ассоциации или диссоциации специфического комплекса DPO4-ДНК, и было предложено несколько альтернативных многоступенчатых путей связывания [41].Эксперимент предоставляет доказательства возможного сосуществования механизмов связывания «индуцированного соответствия» и «конформационного отбора», что приводит к тому, что стадия конформационного изменения может происходить либо до, либо после связывания ДНК. Наши результаты могут еще больше расширить этот предполагаемый механизм связывания и подтвердить, что связывание ДНК с помощью DPO4 включает сочетание как «индуцированного соответствия», так и «конформационного отбора» [90]. Наше моделирование показывает, что существует конформационное равновесие на ранних стадиях связывания DPO4-ДНК (т.е.е. в США, ЕС и IS) с последующим функциональным переключением «A на B» на последнем этапе с IS на BS. Основываясь на ландшафтах свободной энергии и структурном анализе, мы обнаружили, что DPO4 в A-состоянии должен эволюционировать в I-состояние, прежде чем окончательно принять B-состояние.

Этот расширенный процесс конформационного отбора широко используется при гибком биомолекулярном распознавании, приводя к тому факту, что механизм индуцированного соответствия и конформационного отбора следует рассматривать как два противоположных крайних сценария связывания [91] — [95].Степень, в которой два сценария связывания вносят вклад в общий механизм связывания, зависит от множества условий, включая взаимодействия между ассоциированными биомолекулами [89], диапазон взаимодействий [89], концентрации биомолекул [96] и скорость конформационного перехода [97]. Стоит отметить, что распознавание DPO4-ДНК сильно отличается от обычной «смешанной» модели связывания, в которой за индуцированным соответствием часто следует выбор предпочтительных конформаций в этой [94], [98], [99].Перед окончательным связыванием ДНК-связывание «выбирает» DPO4 в A-состоянии вместо I-состояния, которое оказывается неизбежным промежуточным звеном при конформационном изменении из A- в B-состояние. На последней стадии связывания неактивные состояния DPO4 индуцируются сопряженным связыванием и сворачиванием с переходом в B-состояние. Эта ограничивающая скорость стадия связывания при умеренных концентрациях соли следует типичному механизму «индуцированного соответствия». Мы утверждаем, что новый механизм связывания обусловлен энтропией, обусловленной геометрией ДНК, которая способствует A- или B-состоянию, поскольку связывание происходит из приведенных выше обсуждений.Этот механизм связывания, предложенный здесь, может быть применен в случае, когда геометрия ассоциированных биомолекул настолько значительна, что энтропия оказывает сильное влияние на связывание.

Общие и уникальные характеристики связывания ДНК-полимераз семейства Y с ДНК

Многоступенчатый механизм связывания ДНК, включающий конформационные изменения в ориентации LF-домена относительно ядра полимеразы из-за гибкого линкера, описанного здесь для DPO4, также может быть общим для других ДНК-полимераз Y-семейства.Например, кристаллические структуры ДНК-полимераз человека κ (hPOL κ ) показывают конформационное изменение от открытого к закрытому до 50 Å в положении LF-домена относительно ядра полимеразы между апо и ДНК, связанными. состояния [29], [30], аналогично переходу из A- в B-состояние в DPO4. Эта ДНК-полимераза дрожжей (yPOL η ) также может претерпевать сходные конформационные изменения во время связывания ДНК [23], [31], [32]. Однако кристаллические структуры предполагают, что изменение, вероятно, более скромное при повороте домена LF только на 8 ° относительно полимеразного ядра yPOL η [23], [31], [32].Интересно, что LF-домен hPOL κ наблюдался в двух разных конформациях в состоянии апо [29], [30], обе из которых отличаются от конформации, наблюдаемой в связанном состоянии ДНК, что вполне согласуется с результатами нашего моделирования. которые показывают конформационное равновесие в первую очередь между A-состоянием и I-состоянием в США, которые отличаются от B-состояния, которое доминирует в BS.

Во время репликации in vivo , ДНК-полимеразы, как полагают, регулируются скользящими зажимами (PCNA у архей и эукариот или зажимом β у бактерий), которые координируют белки на вилке репликации ДНК [100] — [102].Структурные исследования показали, что в комплексе DPO4-PCNA DPO4 принимает расширенную конформацию, в которой положение LF-домена по отношению к F-, T- и P-доменам отличается от положения в структурах DPO4, связанных как с Апо, так и с ДНК [ 42]. Эта расширенная конформация DPO4, в которой домен LF не формирует взаимодействия с доменами F и T, очень похожа на I-состояние, наблюдаемое в наших симуляциях. Кроме того, экспериментальное предсказание, что гибкий линкер допускает существование равновесия между множественными конформациями DPO4 с и без PCNA или партнера по связыванию ДНК, также подтверждается нашим моделированием.Стоит отметить, что результаты здесь кажутся специфичными для полимераз Y-семейства, поскольку другие семейства ДНК-полимераз не имеют LF-домена и, следовательно, не имеют конформационных изменений между A- и B-состояниями. Уникальные структурные особенности гибкого линкера и LF-домена [103], которые приводят к сложному многоступенчатому процессу связывания, включающему множество конформационных состояний, могут служить для регуляции функций ДНК-полимераз Y-семейства, чтобы они функционировали реально и эффективно, когда репликативные полимеразы останавливаются. в месте повреждения в процессе репликации ДНК.

В нашей работе мы разработали SBM с двумя бассейнами для связывания DPO4 с его целевой ДНК с явным учетом специфических взаимодействий между белком и ДНК. Наши результаты показали, что DPO4 претерпевает неспецифическую трехмерную диффузию, затем неспецифическую короткодействующую регулировку, скользящую по ДНК, и, наконец, специфическое связывание с конформационными изменениями, которые происходят на всех стадиях узнавания во время связывания ДНК. Эффективность распознавания модулируется концентрацией соли, гибкостью линкера и конформационной динамикой DPO4.Наши результаты дают четкую иллюстрацию того, как белок находит свои целевые сайты на ДНК с конформационными изменениями в различных условиях. В дополнение к уникальному пониманию механизма связывания DPO4-ДНК, разработанные нами здесь методы станут мощным инструментом для будущих исследований путей связывания многих различных белков и их целевых ДНК-субстратов.

Материалы и методы

Простой SBM широко использовался для исследования сворачивания белков [45], [46] и связывания [47] — [49].Здесь мы адаптировали простой SBM с уникальной нативной структурой к SBM с двумя бассейнами, чтобы исследовать конформационную динамику в DPO4, а также динамику связывания с ДНК. Наша модель построена на крупномасштабном уровне. Каждый остаток в DPO4 представлен атомом, а каждый нуклеотид в ДНК представлен тремя гранулами, расположенными в центре тяжести сахарной, основной и фосфатной групп без неоднородности. Только Arg и Lys в DPO4 моделируются как несущие один положительный заряд, а Asp и Glu в DPO4, а также псевдоатомы фосфата в ДНК моделируются как несущие один отрицательный заряд.Нативная карта контактов DPO4 представляет собой смесь нативных контактов в нативной структуре A- и B-состояний. Области с крупномасштабными изменениями угла и двугранности между A- и B-состоянием определяются как шарниры. Ожидается, что петли будут более гибкими, чем в других частях DPO4. В нашей системе шарниры DPO4 соответствуют неупорядоченной области в F-домене, когда он находится в A-состоянии, и гибкому линкеру, соединяющему T- и LF-домен. В общем, DPO4 изначально координируется с помощью скользящих зажимов (PCNA у архей и эукариот или зажим β у бактерий) перед связыванием с ДНК во время транслезионного синтеза.После этого DPO4 должен только искать вилку репликации в небольшом участке ДНК. Следовательно, короткая длина праймера / матрицы 14/16-мерного (5′– GGGACCCTTCGAAT –3 ′ / 5′– TTATTC – GAAGGGTCCC –3 ′) ДНК-субстрата используется в наших моделированиях для описания распознавания DPO4-ДНК. . В действительности для разной длины ДНК белки должны проводить разное время скольжения по ДНК, что приводит к разной кинетике связывания. Эффект можно измерить путем количественной оценки взаимодействия между неспецифическим и специфическим связыванием при узнавании белок-ДНК [104].В бинарном комплексе DPO4-ДНК (PDB: 2RDJ) DPO4 контактирует с ДНК посредством многочисленных взаимодействий, включая LF-домен, взаимодействующий с большой бороздкой дуплекса ДНК, и T-домен, взаимодействующий с малой бороздкой, а также взаимодействия между DPO4. и концевые нуклеотиды на ДНК (рис. 9). Эти взаимодействия используются для построения конкретной карты контактов белок-ДНК. Примечательно, что ДНК остается жесткой и замороженной в космосе, в то время как DPO4 остается свободным. Жесткость ДНК в нашей модели снижает гибкость интерфейсов белок-ДНК, что может способствовать быстрому и эффективному обнаружению целевого сайта [19].Однако весь процесс распознавания существенно не изменится из-за небольшой длины ДНК. Дальнейшие исследования динамики ДНК, участвующей в распознавании белок-ДНК, нуждаются в улучшении крупнозернистой модели с учетом гибкости ДНК [105] — [107]. Двухбазовый SBM здесь построен в соответствии с кристаллическими структурами апо-DPO4 (PDB: 2RDI) и DPO4 в бинарном комплексе DPO4-ДНК (PDB: 2RDJ), основанном на нашей предыдущей работе [50], [51]. Следовательно, гамильтониан может быть выражен следующим образом: где — двухбазовый гамильтониан для SBM, — это потенциал для конкретных контактов между DPO4 и ДНК, U _Charged — это потенциал электростатических взаимодействий, которые существуют между всеми парами противоположно заряженных бусы.Дальнодействующие неэлектростатические взаимодействия представлены потенциалом LJ, в то время как электростатические взаимодействия описываются моделью Дебая-Хюккеля, в которой влияние концентрации соли модулируется длиной радиуса Дебая [108]. В последнее время крупнозернистые модели со специфическими белок-нуклеотидными контактами и без них широко применялись для исследования механизма распознавания белок-ДНК, и результаты согласуются с экспериментами [3], [6], [18], [75], [105], [109] — [112].

Рис. 9. Нативные контакты между DPO4 и ДНК в нативной связанной структуре.

(A) Нативные контакты для каждого нуклеотида в ДНК. DPO4 взаимодействует с ДНК в нативной связанной структуре в трех различных областях, которые окрашены в оранжевый, оливково-зеленый и темно-голубой цвет, соответствующие большой бороздке, малой бороздке и концу дуплекса ДНК, соответственно. (B) Нативные контакты для сахара, основания и фосфатной группы в ДНК. (C, D) Нативная структура бинарного комплекса DPO4-ДНК.В (C) сахар, основание и фосфатные группы в ДНК окрашены от синего до красного, что соответствует номеру контакта от 0 до 5; в то время как DPO4 окрашен в серый цвет. В (D) остатки в DPO4 окрашены от синего до красного, что соответствует номеру контакта DPO4-ДНК от 0 до 5, в то время как ДНК окрашена в серый цвет. Контакты DPO4-ДНК обозначены оранжевыми линиями на (C) и (D).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003804.g009

Все симуляции были выполнены с использованием Gromacs 4.0,5 [113], проинтегрировано уравнением Ланжевена с постоянным коэффициентом трения 1,0 пс ⁻¹ . Все связи были ограничены алгоритмом LINCS для обеспечения шага MD 2 фс [114]. Чтобы добиться лучшего отбора проб, мы использовали REMD [55] для изучения термодинамики. Соседние реплики пытались обмениваться друг с другом через каждые 5000 шагов MD. Среднее значение коэффициентов приема-обмена в нашем моделировании REMD составляет от 17% до 37%, что приводит к достаточному количеству образцов. После моделирования REMD были собраны все траектории и рассчитаны ландшафты свободной энергии с помощью алгоритма метода взвешенного анализа гистограмм (WHAM) [115].

Для кинетики было выполнено 200 имитаций при постоянной температуре, начатых из различных диссоциативных A-состояний DPO4 и ДНК с разными скоростями для каждого условия. Различные условия в нашем кинетическом моделировании относятся к разным концентрациям соли, разной гибкости линкера и разной конформационной динамике в DPO4. На практике это может быть реализовано путем модуляции длины радиуса Дебая, силы угла и двугранного потенциала, относящегося к линкеру, и прочности конкретных контактов в A- или B-состоянии.Подробности можно найти в Тексте S1 и в нашей предыдущей работе [50], [51].

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: JW. Проведены эксперименты: XC FL JW. Проанализированы данные: XC FL BAM ZS JW. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты для анализа: XC FL YW JW. Участвовал в написании рукописи: XC BAM ZS HW WH JW.

Ссылки

1. 1.
   Spolar RS, Record Jr MT (1994) Связывание локального фолдинга с сайт-специфическим связыванием белков с ДНК.Наука 263: 777–784.
2. 2.
   Гарви CW, Wolberger C (2001) Распознавание конкретных последовательностей ДНК. Mol Cell 8: 937–946.
3. 3.
   Вузман Д., Азия А., Леви И. (2010) Поиск ДНК с помощью механизма «обезьяньего бара»: значение неупорядоченных хвостов. J Mol Biol 396: 674–684.
4. 4.
   Fuxreiter M, Simon I, Bondos S (2011) Динамическое распознавание ДНК-белок: за гранью того, что можно увидеть. Тенденции Biochem Sci 36: 415–423.
5. 5.
   Doucleff M, Clore GM (2008) Глобальный прыжок и доменно-специфический межсегментный перенос между ДНК-родственными сайтами многодоменного фактора транскрипции Oct-1.Proc Natl Acad Sci USA 105: 13871–13876.
6. 6.
   Vuzman D, Levy Y (2010) Эффективность поиска ДНК модулируется составом и распределением заряда в собственно неупорядоченном хвосте. Proc Natl Acad Sci USA 107: 21004–21009.
7. 7.
   Winter RB, Von Hippel PH (1981) Управляемые диффузией механизмы транслокации белков на нуклеиновых кислотах. 2. Взаимодействие lac-репрессора Escherichia coli с оператором: равновесные измерения. Биохимия 20: 6948–6960.
8. 8.Winter RB, Berg OG, Von Hippel PH (1981) Управляемые диффузией механизмы транслокации белков на нуклеиновых кислотах. 3. Взаимодействие lac-репрессора Escherichia coli с оператором: кинетические измерения и выводы. Биохимия 20: 6961–6977.
9. 9.
   фон Хиппель PH, Берг О. (1989) Облегченное определение местоположения цели в биологических системах. J Biol Chem 264: 675–678.
10. 10.
    Halford SE, Szczelkun MD (2002) Как добраться от A до B: Стратегии анализа движения белков в ДНК.Eur Biophys J 31: 257–267.
11. 11.
    Halford SE, Marko JF (2004) Как сайт-специфичные ДНК-связывающие белки находят свои мишени? Nucleic Acids Res 32: 3040–3052.
12. 12.
    Андраби М., Мизугучи К., Ахмад С. (2013) Конформационные изменения в ДНК-связывающих белках: взаимосвязь с прекомплексными функциями и вклад в специфичность и стабильность. Proteins Struct Funct Bioinform 82: 841–857.
13. 13.
    Pontius BW (1993) Близкие контакты: почему неструктурированные полимерные домены могут увеличивать скорость специфической макромолекулярной ассоциации.Тенденции Biochem Sci 18: 181–186.
14. 14.
    Дункер А.К., Гарнер Э., Гийо С., Ромеро П., Альбрехт К. и др. (1998) Белковые расстройства и эволюция молекулярного распознавания: теория, прогнозы и наблюдения. Pacific Symp Biocomputing 3: 473–84.
15. 15.
    Shoemaker BA, Portman JJ, Wolynes PG (2000) Ускорение молекулярного распознавания с помощью складной воронки: механизм заброса на муху. Proc Natl Acad Sci USA 97: 8868–8873.
16. 16.
    Huang Y, Liu Z (2009) Кинетическое преимущество внутренне неупорядоченных белков в связанном процессе сворачивания-связывания: критическая оценка механизма «мух-заброс».J Mol Biol 393: 1143–1159.
17. 17.
    Zhou HX (2012) Внутреннее расстройство: передача сигналов посредством высокоспецифичных, но недолговечных ассоциаций. Тенденции Biochem Sci 37: 43–48.
18. 18.
    Вузман Д., Леви Ю. (2012) Внутренне неупорядоченные области как регуляторы аффинности во взаимодействиях белок-ДНК. Мол Биосист 8: 47–57.
19. 19.
    Kalodimos CG, Biris N, Bonvin AM, Levandoski MM, Guennuegues M и др. (2004) Адаптация структуры и гибкости в неспецифических и специфических комплексах белок-ДНК.Наука 305: 386–389.
20. 20.
    Омори Х., Фридберг Э., Фукс Р., Гудман М., Ханаока Ф. и др. (2001) Y-семейство ДНК-полимераз. Mol Cell 8: 7–8.
21. 21.
    Ling H, Boudsocq F, Woodgate R, Yang W (2001) Кристаллическая структура ДНК-полимеразы Y-семейства в действии: механизм репликации с предрасположенностью к ошибкам и обходом повреждений. Cell 107: 91–102.
22. 22.
    Silvian LF, Toth EA, Pham P, Goodman MF, Ellenberger T (2001) Кристаллическая структура подверженной ошибкам ДНК-полимеразы семейства DinB из Sulfolobus solfataricus.Nat Struct Mol Biol 8: 984–989.
23. 23.
    Тринкао Дж., Джонсон Р. Э., Эскаланте С. Р., Пракаш С., Пракаш Л. и др. (2001) Структура каталитического ядра ДНК-полимеразы S. cerevisiae η : значение для синтеза ДНК с повреждением. Mol Cell 8: 417–426.
24. 24.
    Pata JD (2010) Структурное разнообразие ДНК-полимераз Y-семейства. Bba-белки Proteom 1804: 1124–1135.
25. 25.
    Боудсок Ф., Кокоска Р.Дж., Плоски Б.С., Вайсман А., Линг Х. и др.(2004) Изучение роли домена мизинца ДНК-полимераз Y-семейства в синтезе с низкой точностью и репликации с повреждениями. J Biol Chem 279: 32932–32940.
26. 26.
    Wong JH, Fiala KA, Suo Z, Ling H (2008) Снимки ДНК-полимеразы Y-семейства в репликации: субстрат-индуцированные конформационные переходы и последствия для верности Dpo4. J Mol Biol 379: 317–330.
27. 27.
    Шерер С. М., Максвелл Б. А., Пак Л. Р., Фиала К. А., Фаулер Д. Д. и др. (2012) Идентификация разворачивающегося промежуточного звена для полимеразы обхода повреждений ДНК.Chem Res Toxicol 25: 1531–1540.
28. 28.
    Wang Y, Chu X, Suo Z, Wang E, Wang J (2012) Многодоменный белок решает проблему сворачивания за счет многопоточного комбинированного ландшафта: теоретическое исследование ДНК-полимеразы Y-семейства. J Am Chem Soc 134: 13755–13764.
29. 29.
    Улджон С.Н., Джонсон Р.Э., Эдвардс Т.А., Пракаш С., Пракаш Л. и др. (2004) Кристаллическая структура каталитического ядра ДНК-полимеразы каппа человека. Структура 12: 1395–1404.
30. 30.
    Лоун С., Таунсон С.А., Ульджон С.Н., Джонсон Р.Э., Брахма А. и др.(2007) ДНК-полимераза человека κ окружает ДНК: значение для расширения несоответствия и обхода поражения. Mol Cell 25: 601–614.
31. 31.
    Alt A, Lammens K, Chiocchini C, Lammens A, Pieck JC и др. (2007) Обход повреждений ДНК, образовавшихся во время противоопухолевого лечения цисплатином, с помощью ДНК-полимеразы η . Наука 318: 967–970.
32. 32.
    Сильверштейн Т.Д., Джонсон Р.Э., Джейн Р., Пракаш Л., Пракаш С. и др. (2010) Структурные основы подавления рака кожи с помощью ДНК-полимеразы η .Природа 465: 1039–1043.
33. 33.
    Fiala KA, Hypes CD, Suo Z (2007) Механизм обхода абазического поражения, катализируемый ДНК-полимеразой Y-семейства. J Biol Chem 282: 8188–8198.
34. 34.
    Fiala KA, Suo Z (2007) Небрежный обход абазического поражения, катализируемый ДНК-полимеразой Y-семейства. J Biol Chem 282: 8199-8206.
35. 35.
    Фиала К.А., Шеррер С.М., Браун Дж. А., Суо З. (2008) Механистические последствия температуры для полимеризации ДНК, катализируемой ДНК-полимеразой Y-семейства.Nucleic Acids Res 36: 1990–2001.
36. 36.
    Beckman JW, Wang Q, Guengerich FP (2008) Кинетический анализ правильной вставки нуклеотидов с помощью ДНК-полимеразы Y-семейства выявляет конформационные изменения как до, так и после образования фосфодиэфирной связи, что определяется флуоресценцией триптофана. J Biol Chem 283: 36711-36723.
37. 37.
    Eoff RL, Sanchez-Ponce R, Guengerich FP (2009) Конформационные изменения во время отбора нуклеотидов ДНК-полимеразой Dpo4 Sulfolobus solfataricus.J Biol Chem 284: 21090–21099.
38. 38.
    Шеррер С.М., Браун Дж. А., Пак Л. Р., Джасти В. П., Фаулер Дж. Д. и др. (2009) Механистические исследования обхода объемного одноосновного поражения, катализируемого ДНК-полимеразой Y-семейства. J Biol Chem 284: 6379–6388.
39. 39.
    Xu C, Maxwell BA, Brown JA, Zhang L, Suo Z (2009) Глобальная конформационная динамика ДНК-полимеразы Y-семейства во время катализа. PLoS биология 7: e1000225.
40. 40.
    Maxwell BA, Xu C, Suo Z (2012) Поражение ДНК изменяет глобальную конформационную динамику ДНК-полимеразы Y-семейства во время катализа.J Biol Chem 287: 13040–13047.
41. 41.
    Maxwell BA, Xu C, Suo Z (2014) Конформационная динамика ДНК-полимеразы Y-семейства во время связывания и катализа субстрата, как обнаружено с помощью междоменного резонансного переноса энергии Ферстера. Биохимия 53: 1768–1778.
42. 42.
    Xing G, Kirouac K, Shin YJ, Bell SD, Ling H (2009) Структурное понимание рекрутирования транслезионной ДНК-полимеразы Dpo4 для скользящего зажима PCNA. Mol Microbiol 71: 678–691.
43. 43.
    Go N (1983) Теоретические исследования сворачивания белков.Анну Рев Biophys Bioeng 12: 183–210.
44. 44.
    Bryngelson JD, Onuchic JN, Socci ND, Wolynes PG (1995) Воронки, пути и энергетический ландшафт сворачивания белков — синтез. Белки 21: 167–195.
45. 45.
    Clementi C, Nymeyer H, Onuchic JN (2000) Топологические и энергетические факторы: что определяет структурные детали ансамбля переходных состояний и промежуточных звеньев «на пути» для сворачивания белка? Исследование малых глобулярных белков. J Mol Biol 298: 937–953.
46. 46.
    Ноэль Дж. К., Уитфорд ПК, Санбонмацу К. Ю., Онучич Дж. Н. (2010) SMOG @ ctbp: Упрощенное развертывание структурных моделей в GROMACS. Нуклеиновые кислоты Res 38: W657 – W661.
47. 47.
    Levy Y, Wolynes PG, Onuchic J (2004) Топология белка определяет механизм связывания. Proc Natl Acad Sci USA 101: 511–516.
48. 48.
    Леви Ю., Чо С.С., Онучич Дж., Волинес П.Г. (2005) Обзор гибких механизмов связывания белков и их переходных состояний с использованием энергетических ландшафтов на основе нативной топологии.J Mol Biol 346: 1121–1145.
49. 49.
    Леви Ю., Онучич Дж. Н. (2006) Механизмы сборки белка: уроки минималистских моделей. Acc Chem Res 39: 135–142.
50. 50.
    Wang Y, Tang C, Wang E, Wang J (2012) Исследование конформационной динамики с несколькими состояниями и лежащего в основе глобального функционального ландшафта белка, связывающего мальтозу. PLoS Comput Biol 8: e1002471.
51. 51.
    Wang Y, Gan L, Wang E, Wang J (2012) Изучение динамического функционального ландшафта аденилаткиназы, модулируемого субстратами.J Chem Theory Comput 9: 84–95.
52. 52.
    Ван Дж, Ван Й, Чу Х, Хаген С.Дж., Хан В. и др. (2011) Многоуровневые исследования индуцированного связыванием сворачивания изначально неупорядоченного белкового ингибитора IA3 с его ферментом-мишенью. PLoS Comput Biol 7: e1001118.
53. 53.
    Чу Х, Ван И, Ган Л, Бай И, Хан В и др. (2012) Важность электростатических взаимодействий в ассоциации изначально неупорядоченного гистонового шаперона Chz1 и гистона h3A.Z-h3B. PLoS Comput Biol 8: e1002608.
54. 54.
    Ganguly D, Zhang W, Chen J (2013) Электростатически ускоренное столкновение и сворачивание для легкого распознавания внутренне неупорядоченных белков. PLoS Comput Biol 9: e1003363.
55. 55.
    Okamoto Y, Sugita Y (1999) Метод молекулярной динамики с обменом реплик для сворачивания белка. Chem Phys Lett 314: 141–151.
56. 56.
    Schreiber G (2002) Кинетические исследования белок-белковых взаимодействий. Curr Opin Struc Biol 12: 41–47.
57. 57.Kjaergaard M, Teilum K, Poulsen FM (2010) Конформационный отбор в состоянии расплавленной глобулы ядерного домена связывания коактиватора CBP. Proc Natl Acad Sci USA 107: 12535–12540.
58. 58.
    Ganguly D, Chen J (2011) Моделирование на основе топологии внутренне неупорядоченных белков: балансировка внутренней укладки и межмолекулярных взаимодействий. Proteins Struct Funct Bioinform 79: 1251–1266.
59. 59.
    Потоян Д.А., Папоян Г.А. (2011) Анализ энергетического ландшафта неупорядоченных гистоновых хвостов показывает особую организацию их конформационной динамики.J Am Chem Soc 133: 7405–7415.
60. 60.
    Knott M, Best RB (2012) Предварительно сформированный интерфейс связывания в несвязанном ансамбле изначально неупорядоченного белка: данные молекулярного моделирования. PLoS Comput Biol 8: e1002605.
61. 61.
    Ван И, Чу Х, Лонги С., Рош П., Хан В. и др. (2013) Многоуровневое исследование сопряженного сворачивания и связывания внутренне неупорядоченного молекулярного распознающего элемента в нуклеопротеине вируса кори. Proc Natl Acad Sci USA 110: E3743 – E3752.
62. 62.
    She Q, Singh R, Confalonieri F, Zivanovic Y, Allard G и др. (2001) Полный геном кренархея sulfolobus solfataricus P2. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 7835–7840.
63. 63.
    Boudsocq F, Iwai S, Hanaoka F, Woodgate R (2001) Sulfolobus solfataricus P2 ДНК-полимераза IV (Dpo4): архейная DinB-подобная ДНК-полимераза со свойствами обхода повреждений, схожими с эукариотическим pol η . Nucleic Acids Res 29: 4607–4616.
64. 64.
    Ubbink M (2009) Ухаживание за белками: понимание комплекса встречи.Febs Lett 583: 1060–1066.
65. 65.
    Винклер Ф.К., Баннер Д.В., Эфнер С., Церноглоу Д., Браун Р. и др. (1993) Кристаллическая структура эндонуклеазы ecorv и ее комплексов с родственными и неродственными фрагментами ДНК. EMBO J 12: 1781.
66. 66.
    Виадиу Х., Аггарвал А. (2000) Структура bamhi, связанная с неспецифической ДНК: модель скольжения ДНК. Mol Cell 5: 889–895.
67. 67.
    Бенос П.В., Лапедес А.С., Стормо Г.Д. (2002) Существует ли код для распознавания ДНК-белок? Вероятно (илилистически) лы.Биологические исследования 24: 466–475.
68. 68.
    Рохс Р., Джин Икс, Вест С.М., Джоши Р., Хониг Б. и др. (2010) Истоки специфичности распознавания ДНК-белок. Анну Рев Биохим 79: 233.
69. 69.
    Marcovitz A, Levy Y (2011) Нарушение связывания белок-ДНК влияет на конформационное переключение и кинетику поиска цели. Proc Natl Acad Sci USA 108: 17957–17962.
70. 70.
    Marcovitz A, Levy Y (2013) Слабое расстройство регулирует кинетику скольжения и связывания на прочных белково-ДНК-ландшафтах.J. Phys Chem B 117: 13005–13014.
71. 71.
    Линг Х., Боудсок Ф., Плоски Б.С., Вудгейт Р., Янг В. (2003) Репликация цис-синтиминового димера при атомном разрешении. Nature 424: 1083–1087.
72. 72.
    Ling H, Boudsocq F, Woodgate R, Yang W (2004) Снимки репликации через абазическое поражение: структурная основа для замен оснований и сдвигов рамки. Mol Cell 13: 751–762.
73. 73.
    Линг Х., Сэйер Дж. М., Плоски Б. С., Яги Х., Баудсок Ф. и др. (2004) Кристаллическая структура аддукта эпоксида бензо [a] пирендиола в тройном комплексе с ДНК-полимеразой.Proc Natl Acad Sci USA 101: 2265–2269.
74. 74.
    Bauer J, Xing G, Yagi H, Sayer JM, Jerina DM, et al. (2007) Структурный разрыв в Dpo4 поддерживает мутагенный обход основного бензо [a] пиренового аддукта dg в ДНК через смещение матрицы. Proc Natl Acad Sci USA 104: 14905–14910.
75. 75.
    Вузман Д., Полонский М., Леви Ю. (2010) Облегченный поиск ДНК с помощью факторов мультидоменной транскрипции: перекрестный обмен через гибкий линкер. Biophys J 99: 1202–1211.
76. 76.Tompa P, Fuxreiter M (2008) Нечеткие комплексы: полиморфизм и структурное нарушение во взаимодействиях белок-белок. Trends Biochem Sci 33: 2–8.
77. 77.
    Mittag T, Kay LE, Forman-Kay JD (2010) Динамика белков и конформационное нарушение в молекулярном распознавании. J Mol Recognit 23: 105–116.
78. 78.
    Фиала К.А., Суо З. (2004) Механизм полимеризации ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой IV sulfolobus solfataricus P2. Биохимия 43: 2116–2125.
79. 79.Brenlla A, Markiewicz RP, Rueda D, Romano LJ (2013) Селекция нуклеотидов с помощью ДНК-полимеразы Dpo4 Y-семейства включает транслокацию и несовпадение матрицы. Nucleic Acids Res 42: 2555–2563.
80. 80.
    Фишер Э. (1894) Конфигурация фермента. Ber Dtsch Chem Ges 27: 2984–2993.
81. 81.
    Кошланд Д.Е. (1958) Применение теории специфичности ферментов к синтезу белка. Proc Natl Acad Sci USA 44: 98–104.
82. 82.Ma BY, Kumar S, Tsai CJ, Nussinov R (1999) Складные воронки и механизмы связывания. Protein Eng 12: 713–720.
83. 83.
    Tsai CJ, Kumar S, Ma BY, Nussinov R (1999) Складные воронки, связывающие воронки и функция белка. Protein Sci 8: 1181–1190.
84. 84.
    Цай CJ, Ma BY, Nussinov R (1999) Складные и связывающие каскады: сдвиги в энергетических ландшафтах. Proc Natl Acad Sci USA 96: 9970–9972.
85. 85.
    Kumar S, Ma BY, Tsai CJ, Sinha N, Nussinov R (2000) Складывающиеся и связывающие каскады: динамические ландшафты и миграции населения.Protein Sci 9: 10–19.
86. 86.
    Цай К.Дж., Ма Б., Шам Й.Й., Кумар С., Нусинов Р. (2001) Структурный беспорядок и конформационный отбор. Proteins Struct Funct Bioinform 44: 418–427.
87. 87.
    Bosshard HR (2001) Молекулярное распознавание путем индуцированной подгонки: насколько соответствует эта концепция? Новости Physiol Sci 16: 171–173.
88. 88.
    Estabrook RA, Reich N (2006) Наблюдение за механизмом индуцированной подгонки во время специфичного для последовательности метилирования ДНК. J Biol Chem 281: 37205–37214.
89. 89.
    Окадзаки Ки, Такада С. (2008) Вид динамического энергетического ландшафта сопряженного связывания и конформационного изменения белка: механизмы индуцированного соответствия и популяционного сдвига. Proc Natl Acad Sci USA 105: 11182–11187.
90. 90.
    Csermely P, Palotai R, Nussinov R (2010) Индуцированная подгонка, конформационный отбор и независимые динамические сегменты: расширенный взгляд на события связывания. Тенденции Biochem Sci 35: 539–546.
91. 91.
    Boehr DD, Wright PE (2008) Как взаимодействуют белки? Наука 320: 1429–1430.
92. 92.
    Бор Д.Д., Нусинов Р., Райт П.Е. (2009) Роль динамических конформационных ансамблей в биомолекулярном распознавании. Nat Chem Biol 5: 789–796.
93. 93.
    Espinoza-Fonseca LM (2009) Согласование механизмов связывания внутренне неупорядоченных белков. Biochem Bioph Res Co 382: 479–482.
94. 94.
    Bucher D, Grant BJ, McCammon JA (2011) Индуцированная подгонка или конформационный отбор? Роль полузакрытого состояния в белке, связывающем мальтозу.Биохимия 50: 10530–10539.
95. 95.
    Ван Кью, Чжан П., Хоффман Л., Трипати С., Хомуз Д. и др. (2013) Распознавание и отбор белков посредством конформационного и взаимно индуцированного соответствия. Proc Natl Acad Sci USA 110: 20545–20550.
96. 96.
    Hammes GG, Chang YC, Oas TG (2009) Конформационный отбор или индуцированная подгонка: описание механизма реакции. Proc Natl Acad Sci USA 106: 13737–13741.
97. 97.
    Zhou HX (2010) От индуцированного соответствия к конформационному отбору: континуум механизма связывания, контролируемый временной шкалой конформационных переходов.Biophys J 98: L15 – L17.
98. 98.
    Грюнберг Р., Лекнер Дж., Нилгес М. (2004) Комплементарность структурных ансамблей в связывании белок-белок. Структура 12: 2125–2136.
99. 99.
    Влодарский Т., Загрович Б. (2009) Конформационный отбор и механизм индуцированной подгонки лежат в основе специфичности нековалентных взаимодействий с убиквитином. Proc Natl Acad Sci USA 106: 19346–19351.
100. 100.
     Lenne-Samuel N, Wagner J, Etienne H, Fuchs RP (2002) Фактор процессивности β контролирует трафик ДНК-полимеразы IV во время спонтанного мутагенеза и синтеза трансфузии in vivo.EMBO Rep 3: 45–49.
101. 101.
     Friedberg EC, Lehmann AR, Fuchs RP (2005) Торговые места: как ДНК-полимеразы переключаются во время трансфузионного синтеза ДНК? Mol Cell 18: 499–505.
102. 102.
     Янсен Дж. Г., Фустери М. И., де Винд Н. (2007) Отправить в зажимы: Контроль синтеза трансформации ДНК у эукариот. Mol Cell 28: 522–529.
103. 103.
     Yang W (2003) ДНК-полимеразы восстановления повреждений Y. Curr Opin Struc Biol. 13: 23–30.
104. 104.
     Слуцкий М., Мирный Л. (2004) Кинетика взаимодействия белок-ДНК: облегченное расположение мишени в зависимом от последовательности потенциале.Biophys J 87: 4021-4035.
105. 105.
     Terakawa T, Kenzaki H, Takada S (2012) поиск p53 на ДНК путем несвязанного с вращением скольжения по c-концевым хвостам и ограниченного перескока основных доменов. J Am Chem Soc 134: 14555–14562.
106. 106.
     Sambriski EJ, Schwartz DC, de Pablo JJ (2009) Мезомасштабная модель ДНК и ее ренатурации. Biophys J 96: 1675–1690.
107. 107.
     Ouldridge TE, Louis AA, Doye JPK (2011) Структурные, механические и термодинамические свойства крупнозернистой модели ДНК.J. Chem Phys 134: 085101–085122.
108. 108.
     Азия А., Леви Й. (2009) Неестественные электростатические взаимодействия могут модулировать сворачивание белка: Молекулярная динамика с долей скептицизма. J Mol Biol 393: 527–542.
109. 109.
     Levy Y, Onuchic JN, Wolynes PG (2007) Привязка мух в связывании белок-ДНК: нарушение сворачивания белка и электростатики облегчает распознавание цели. J Am Chem Soc 129: 738–739.
110. 110.
     Гивати О., Леви Ю. (2009) Белок, скользящий по ДНК: динамика и структурная характеристика.J Mol Biol 385: 1087–1097.
111. 111.
     Toth-Petroczy A, Simon I, Fuxreiter M, Levy Y (2009) Неупорядоченные хвосты гомеодоменов облегчают распознавание ДНК, обеспечивая компромисс между сворачиванием и специфическим связыванием. J Am Chem Soc 131: 15084–15085.
112. 112.
     Marcovitz A, Levy Y (2009) Димеризация Arc-репрессоров на ДНК: повышение скорости сворачивания путем совместной локализации. Biophys J 96: 4212–4220.
113. 113.
     Hess B, Kutzner C, van der Spoel D, Lindahl E (2008) GROMACS 4: Алгоритмы для высокоэффективного, сбалансированного по нагрузке и масштабируемого молекулярного моделирования.J Chem Theory Comput 4: 435–447.
114. 114.
     Hess B, Bekker H, Berendsen HJ, Fraaije JG (1997) LINCS: решатель линейных ограничений для молекулярного моделирования. J Comput Chem 18: 1463–1472.
115. 115.
     Кумар С., Бузида Д., Свендсен Р. Х., Коллман П. А., Розенберг Дж. М. (1992) Метод анализа взвешенной гистограммы для расчетов свободной энергии биомолекул1. Метод. J Comput Chem 13: 1011–1021.

Бета-секретаза как мишень для открытия лекарств от болезни Альцгеймера: обзор методов in vitro для характеристики ингибиторов

Походы, чтобы разбудить аппетит

Хор риолитовых колонн на тропе к Сердцу Скал в Национальном памятнике Чирикауа.(Фото: Боб Миллер)

Кто не начинает новый год с множества разрешений? Если вы хотите больше путешествовать, увидеть больше Аризоны и вкусно поесть, я вас прикрыл.

Вот походы из моей новой книги «Boots & Burgers: Arizona Handbook for Hungry Hikers». Он доступен в Интернете и в книжных магазинах по всему штату.

Помимо описаний маршрутов и информации о ресторанах, вы найдете предложения по достопримечательностям и мероприятиям, исторические лакомые кусочки, бессвязные мысли и большие кусочки причудливости.

Автозапуск

Показать миниатюры

Показать подписи

Последний слайдСледующий слайд

Fountain Hills

Ботинки: North Trail. Если вы боитесь походов по пустыне, начните с этой прогулки в региональном парке Макдауэлл-Маунтин. Это как выйти на улицу с тренировочными колесами.

Плоская, широкая и легкая дорога North Trail проходит через прекрасный уголок пустыни. Пронумерованные маркеры обозначают растения и ориентиры. К тому времени, когда вы закончите 3,1-мильную петлю, вы узнаете много о местной флоре и о том, как они выживают и взаимодействуют.Просто возьмите путеводитель в центре для посетителей, прежде чем отправиться в путь.

Тропа начинается на площадке для пикника. Почти сразу вы дойдете до перекрестка, на котором поверните направо. Региональный парк Макдауэлл Маунтин охватывает 21 099 акров низких пустынных равнин и предгорий. В 1995 году возникший в результате молнии лесной пожар поразил большую часть парка, но территория вокруг Норт-Трейл была сохранена.

Сонора — самая биологически разнообразная пустыня в Северной Америке. Вы получите представление об этой суровой, но удивительно хрупкой экосистеме благодаря вашему путеводителю.Единственный небольшой минус в том, что маркеры явно были на месте какое-то время. В некоторых случаях растения, которые они идентифицировали, с тех пор ушли в ту большую пустыню в небе. Так что не расстраивайтесь, если вы не можете найти все, что рекламируется.

Маршрут никогда не получается даже слегка сложным, хотя иногда он погружается в песчаную полосу и выходит из нее. Он также популярен среди байкеров, что я полностью понимаю. Если бы я катался на горном велосипеде, я бы выбрал именно такой маршрут, а не техничный.Смотрители парка часто проводят по этой тропе походы в полнолуние.

На обратном пути вы сможете полюбоваться видами далеких гор, включая Мазатцалы и Суеверия. Когда вы будете готовы к более дикой пустыне, они ждут вас.

Подробная информация: 16300 Макдауэлл Маунтин-Парк Драйв, к северу от Фаунтин-Хиллз. 480-471-0173, www.maricopa.gov/parks/mcdowell.

Бургеры: Paradise Valley Burger Co. Большинство продуктов, которые доставляют в пластиковых корзинах — и я говорю здесь авторитетно — не отличаются своей презентацией.Поэтому я был приятно удивлен, когда прибыл мой гамбургер Beach House. Обжаренный в домашних условиях перец поблано украшал пирожок. Идеально расположенный по центру холм из копченой моцареллы уравновешивал пирамиду свежего пико де галло. Я восхищался артистизмом около двух секунд, затем прижался к крышке булочки с булочками и нырнул внутрь.

Соединение закрепляет один конец торгового центра. Это урезанный бизнес без излишеств, который позволяет шеф-повару и владельцу Брету Шапиро складывать все в корзину. Гамбургеры для гурманов подаются за гораздо меньшую цену, чем в высококлассных swanketerias.Измельченный фарш поступает из местного мясного магазина и превращается в деревенский, скалистый пирожок. Другой крупный продавец — Burger Brûlée. Пригоревший на булочке сахар добавляет сладости, в то время как яйцо, бекон и сыр скрепляются в хрустящей вкусной упаковке.

Детали: 4001 Э. Белл Роуд, Феникс. 602-535-4930, www.pvburgercompany.com.

Kingman

Ботинки: Monolith Garden Trail. Kingman сохраняет свою награду за пешие прогулки на низком уровне. Город проложил красивую сеть троп, пересекающих зону отдыха предгорья Цербата, но мало что делает для их продвижения.Тропа Монолитного сада — мой любимый, запутанный маршрут через драматические поля валунов и осыпающиеся валы вулканического пепла.

Три начала маршрута и несколько развилок делают Монолит-Гарденс чем-то вроде лабиринта. Для умеренной 8-мильной петли я начал с тропы Метвелл и пересек скалистые холмы, усеянные окотилло и шипами для распятия. Вскоре после прохождения ворот я добрался до участка петли, который взял по часовой стрелке.

Я проехал два перекрестка, ответвляющихся направо, на каждом из которых есть общий маркер следа.Их можно использовать, если вы предпочитаете делать более короткие петли. Я продолжаю двигаться прямо и вскоре обхожу край небольшого каньона с зубчатыми каменными стенами.

Пустыня Мохаве более унылая пустыня, чем Сонора. Растительность более случайна и лишена вертикальных нот сагуаро. Тропа продолжается через холмистый ландшафт с невысокими наклонными холмами, мимо уложенных друг на друга каменных башен и горбатых хребтов, покрытых зубцами колонн.

Когда я повернулся назад, я проигнорировал пару немаркированных троп, идущих слева.Затем я миновал другую петлю, идущую справа. На третьем перекрестке я повернул направо. Я продолжил этот сегмент, несмотря на очередной поворот с маркером тропы. (Серьезно, Кингман, беги за лучшими знаками.) Наконец я добрался до знакомого перекрестка и повернул обратно к своему грузовику.

Хорошая идея — зайти в Центр для посетителей Кингмана или в Бюро управления земельными ресурсами и взять карту. И носите с собой много воды. Тени не так много.

Подробная информация: С межштатной автомагистрали 40 поверните на север по улице U.С. 93 (выход 48). Пройдите 0,5 мили и поверните налево на Metwell Drive, затем пройдите 0,1 мили до грунтовой дороги. Поверните направо к тропе. Бесплатно. 928-718-3700, www.blm.gov/az/st/en/prog/recreation/hiking/monolith.html.

Бургеры: Барбекю из южной ямы Redneck. Несмотря на то, что я заядлый гамбургер, вот моя теория: если вы приехали в незнакомый город и ничего не знаете о ресторанах, поешьте в месте для барбекю. Люди не открывают барбекю в рамках какого-то бизнес-плана. Они делают это, потому что всю жизнь готовят барбекю.

В течение многих лет Бубба и Тэмми Флойд подавали домашнюю тушеную свинину, ребрышки медленного приготовления и сытные гарниры на мероприятиях округа Мохаве. Когда в 2009 году Floyds открыли уютную закусочную, толпы хлынули сюда, жаждавшие большего.

Redneck’s специализируется на мясных ребрышках в стиле Сент-Луис. Они предлагают лишь намек на сопротивление, отказываясь сдаваться без укуса. Но какой бы вкусной ни была еда, оставьте место для пирога. The Ultimate Frozen Lemon Pie — это возвышающаяся стопка сливочно-лимонного вкуса, которая приходит, как покрытый солнечным светом.

Подробная информация: 420 E. Beale St. 928-757-8227, www.redneckss Southernpitbbq.com.

Юго-Восточная Аризона

Ботинки: Сердце Скал. Национальный памятник Чирикауа площадью 12 000 акров, спрятанный в юго-восточной части штата, скрывает экзотический массив скульптурного камня. Массивные колонны, тонкие шпили и невероятно сбалансированные валуны возвышаются над бревнами.

Около 27 миллионов лет назад извержение вулкана выбросило пепел и пемзу на площадь более 1200 квадратных миль.Смесь остыла и превратилась в туф риолита. Несколько эонов эрозии превратили скалу в очаровательный лес формаций. Апачи чирикауа назвали эти горы «страной возвышающихся скал».

Сеть троп предлагает несколько вариантов пеших прогулок. Короткая петля через Сердце Скал — это скалистое ядро ​​парка, где вы найдете самую впечатляющую коллекцию образований. Самый простой маршрут к Сердцу Скал — это три тропы: Эд Риггс (0,9 мили), Грибная скала (1.2 мили) и Big Balanced Rock (1 миля).

От стоянки Echo Canyon начните с Ed Riggs, который постепенно спускается в ущелье, окруженное сломанными колоннами и каменными толчками. Тропа заканчивается на перекрестке с тремя дорогами. Прыгайте по тропе Грибной скалы. Вы увидите Грибной камень в четверти мили над деревьями справа от вас. Если вы немного не в восторге, не переживайте. Впереди еще много драматических образований.

Тропа проходит через лесной овраг, где соединяется с Большой сбалансированной каменной тропой.Шрамы от ожогов здесь и в других местах — результат пожара 2011 года. Big Balanced Rock следует за высокой линией хребта с потрясающими видами. Ищите Cochise Head, поразительную гору, которая предлагает профиль Cochise. Вскоре вы проходите по коридору из уложенных друг на друга камней и капюшонов. Ближе к концу тропы вы заметите одноименный 1000-тонный валун, расположенный на большом пальце камня. Отсюда короткий отрог ведет к Heart of Rocks.

Возьмите петлю длиной 1,1 мили по часовой стрелке, чтобы обеспечить лучший обзор.